人參稀有皂苷Compound K混合膠束的處方優化及體外評價

錢　薇，于兆慧，朱云澤（.江蘇省揚州五臺山醫院藥械科，江蘇揚州　5003；.南京中醫藥大學藥學院，南京　003）

人參稀有皂苷Compound K混合膠束的處方優化及體外評價

錢薇1＊，于兆慧2，朱云澤1（1.江蘇省揚州五臺山醫院藥械科，江蘇揚州225003；2.南京中醫藥大學藥學院，南京210023）

目的：優化人參稀有皂苷Compound K（CK）混合膠束的處方，考察其體外釋放度和表觀滲透系數（Papp）。方法：以大豆磷脂和維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）為輔料，采用溶劑揮發法制備CK混合膠束。以載藥量、包封率、粒徑為指標，采用正交試驗優化投藥量、大豆磷脂-TPGS比例、水化體積。考察最優處方所制膠束的形態、粒徑、載藥量、包封率、溶解度、體外釋放度和在結腸腺癌Caco-2細胞模型中的Papp。結果：CK混合膠束的最優處方投藥量為1.0 mg，大豆磷脂-TPGS比例為1∶1，水化體積為10 ml。所制混合膠束呈球形或類球形，平均粒徑為（110±2.69）nm，載藥量為（4.32±0.19）%，包封率為（92.23±2.76）%，溶解度為（469.21±0.024）μg/ml，150 h時累積釋放度為（66.19±0.027）%（n＝3）。CK原料藥和CK混合膠束的Papp分別為26.20、3.78（n＝6）。結論：優化的制備工藝可行，成功制得CK混合膠束。

人參稀有皂苷Compound K；混合膠束；正交試驗；處方優化；結腸腺癌Caco-2細胞

人參稀有皂苷Compound K（CK）是天然人參二醇組皂苷在體內的主要代謝產物，是人參皂苷在體內發揮作用的成分[1-2]。由于其具有特殊的抗腫瘤活性[3-4]，所以具有極高的藥用價值。然而，CK在人參藥材中的含量極低，且溶解性極差、外排性較大、生物利用度低[5-9]。

膠束作為藥物載體，具有提高藥物溶解度和安全性、降低毒副作用、增強藥物療效等優點[10-14]。維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）是維生素E琥珀酸酯（VES）的羧基與聚乙二醇（PEG）酯化而成的水溶性衍生物，其分子質量約為1 513，親水親油平衡值約為13～17。由于TPGS具有兩親性和良好的親水性，因此常被用作親脂性物質的非離子型表面活性劑。TPGS已載入《美國藥典》，且在美國也已有以TPGS為輔料上市的藥品，如安普那韋（AgeneraseTM）口服液和膠囊[15]。此外，已有研究報道，TPGS也可應用于脂質體、膠束、前體藥物以及共聚物載體以提高制劑的溶解度、滲透性及穩定性[16-18]，促進藥物吸收。大豆卵磷脂是由疏水基脂肪酸鏈和親水基磷酸及膽堿組成的兩親性表面活性劑，具有一系列膠體性質和明顯的乳化性[19]。本研究以TPGS和大豆卵磷脂為聯合載體制備了CK混合膠束，采用正交試驗優化了處方工藝，并考察其體外性質。

1　材料

1.1儀器

Agilent 1260系列高效液相色譜（HPLC）儀、液質聯用（LC-MS）系統（美國Agilent公司）；Zetasizer-Nano-2S型激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；旋轉蒸發儀（南京炳輝儀器儀表有限公司）；JEM-1200EX型透射電鏡（日本Jeol公司）；RS-80型智能釋放試驗儀器（天津大學無線電廠）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2藥品與試劑

CK（南京中醫藥大學自制，批號：20141209，純度：＞90%）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業有限公司，批號：20140701）；人參皂苷Rg3（中國食品藥品檢定研究院，批號：11084-200603，純度：＞98%）；DMEM培養基（南京凱基生物科技發展有限公司）；TPGS（批號：101241196）、Hank’s平衡鹽（HBSS）粉末（美國Sigma公司）；0.5%聚山梨酯80（上海紫一試劑廠，批號：20120907）；甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

1.3細胞

結腸腺癌Caco-2細胞，由美國休斯頓大學藥學院藥理和藥物科學系Ming Hu博士饋贈。

2　方法

2.1CK混合膠束的制備及優化

2.1.1混合膠束的制備采用溶劑揮發法制備CK混合膠束。精密稱取一定量的藥物和大豆卵磷脂加入到裝有10 ml無水乙醇的旋轉蒸發瓶中，常壓50下40 r/min旋轉1 h；然后向其中加入一定量的表面活性劑TPGS，在相同條件下反應1 h；隨后在減壓條件下旋轉蒸發除去反應溶劑，在旋轉蒸發瓶底部形成一層透明薄膜；再向其中加入一定量預熱的雙蒸水，以100 r/min水化一段時間；經0.45 μm微孔濾膜過濾，得澄清乳藍色的載藥膠溶液，部分溶液冷凍干燥，得CK混合膠束的凍干粉。

2.1.2處方工藝的優化在單因素試驗的基礎上，固定藥輔比為1∶20的情況下，選擇投料量（A，mg）、大豆卵磷脂-TPGS的質量比（B）、水化體積（C，ml）作為考察因素，采用L9（34）正交表進行試驗，以載藥量（w1）、包封率（w2）、粒徑大小（d）為指標對處方進行優化。根據各個指標對CK混合膠束的影響程度，確定其權重分別為0.4、0.4、0.2，計算綜合評分（Z）＝（w1i/ w1max×0.4+w2i/w2max×0.4－di/dmax×0.2）×100，式中w1i為載藥量，w2i為包封率，d為平均粒徑大小，w1max為最大載藥量，w2max為最大包封率，dmax為最大平均粒徑。

2.1.3驗證試驗分別精密稱取10.0 mg CK，3份，分別按最優處方工藝制備3批樣品，測定其載藥量、包封率、粒徑。

2.2CK混合膠束體外性質考察

2.2.1形態考察與粒徑測定將CK混合膠束經適當稀釋后，取一滴膠束溶液至銅網上（覆有硝基纖維素），自然晾干后滴加2%磷鎢酸染色，用濾紙吸取多余的液體，放置10 min，自然干燥，使粒子在銅網上濃縮沉積，用透射電鏡觀察并拍照。另取CK混合膠束溶液適量，利用馬爾文粒徑測定儀測定混合膠束的粒徑。

2.2.2載藥量和包封率的測定采用HPLC法測定CK混合膠束中CK的含量。色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～8 min，40%A；8～35 min，64.3%A；35～45 min，40%A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30；進樣量：20 μl。以質量濃度（c）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標，進行線性回歸。按相關方法操作，考察方法回收率、日內和日間精密度。由于CK的水溶性很差，所以未包封的藥物主要是以顆粒形式存在于制得的膠束溶液中，離心過濾即可除去，游離在水中的CK的量可以忽略不計，因此離心過濾得到的膠束溶液（濾液部分）中的藥物即為包封的藥物量。將CK混合膠束溶液用乙醇稀釋，離心過濾后的濾液用乙醇稀釋，測定包封的藥量。按公式計算包封率（%）＝（mM/mF）×100%；載藥量（%）＝[mM/（mP+mM）]×100%，其中，mM為膠束包封的藥量，mP為輔料的質量，mF為開始時CK的投料量。

2.2.3溶解度的測定取過量的CK混合膠束冷凍干燥粉分散于2 ml的蒸餾水中，置于37的氣浴恒溫振蕩器中，以轉速40 r/min振蕩24 h，直至達到溶解平衡。將該溶液以13 000 r/min（離心半徑12 cm）離心15 min，然后0.45 μm的微孔濾膜過濾，測定濾液中CK的含量，計算溶解度。每個試驗平行3次。

2.2.4釋放度考察采用漿法，轉速為100 r/min，溫度為（37± 0.5），溶出介質為經過超聲脫氣的pH 6.8的模擬腸液900 ml，加入0.5%的聚山梨酯80，將2 ml的CK混合膠束或CK原料藥加入到透析袋中，將透析袋置于溶出杯中進行體外釋放試驗。CK混合膠束的取樣時間分別為1、2、4、8、12、24、48、60、72、96、120、150 h，CK原料藥的取樣時間分別為1、2、4、8、12、24、48、60、72 h，取樣量為2 ml，同時補加等體積的新鮮溶出介質。樣品液過0.45 μm的微孔濾膜過濾，測定CK的含量，計算累積釋放度，繪制釋藥曲線。每個試驗平行3次。

2.2.5體外Caco-2細胞模型吸收特性評價試驗前首先用37預熱無菌的HBSS溶液（pH 7.4）洗滌Caco-2細胞單層3次，測定跨膜電阻，棄去跨膜電阻值不符合要求的。再加入預熱的HBSS溶液，于37搖床中孵育1 h，吸棄HBSS溶液。對于藥物從Caco-2細胞絨毛面Apical（A）側到基底面Basolateral（B）側的轉運：將藥物溶液2.9 ml加到A側作為供給池，同時B側加入空白HBSS溶液（pH＝7.4）2.5 ml作為接收池；對于藥物從B側到A側的轉運：將藥物溶液2.9 ml加到B側作為供給池，空白HBSS溶液2.5 ml加到A側作為接收池。把加好藥物溶液和空白HBSS溶液的Transwell培養板，置于轉速為50 r/ min的37恒溫搖床中，分別在0、1、2、3、4 h吸取供給池溶液和接收池溶液各400 μl，同時補足相應的溶液。測定電阻和CK的含量，計算CK透過Caco-2細胞單層的表觀滲透系數（Papp）＝（dQ/dt）/SC，式中dQ/dt為接收池藥物出現的速率，S為膜面積（4.2 cm2），C為藥物的初始濃度。Papp值越大，通透率越高[9]。每個試驗平行3次。

3　結果

3.1處方優化

因素與水平見表1，正交試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

由表2結果表明，各因素對CK混合膠束的制備影響順序依次為A＞C＞B。由表3結果表明，A和C對CK混合膠束的制備有顯著影響（P＜0.01）。綜合考慮，CK混合膠束的最優處方工藝為A3B2C1，即投料量為2.0 mg，大豆卵磷脂-TPGS的質量比為2∶1，水化體積為10ml。

3.2處方工藝驗證

按“3.1”項最優處方制備3批樣品。結果3批樣品的平均粒徑為（110±2.69）nm，平均包封率為（92.23±2.76）%，平均載藥量為（4.32±0.19）%（n＝3），見表4。

表2　正交試驗設計與結果Tab 2　Design and results of orthogonal test

表3　方差分析結果Tab 3　Results of variance analysis

表4　驗證試驗結果Tab 4　Results of validation test

3.3CK混合膠束的形態和粒徑

CK混合膠束的微粒子呈規則的球形或類球形，推測可能是大豆卵磷脂與TPGS共同作用形成外圍結構將疏水藥物CK包裹其中，混合膠束的粒徑分布為31～1 000 nm。CK混合膠束的透射電鏡圖見圖1，粒度分布圖見圖2。

圖1　CK混合膠束的透射電鏡圖Fig 1　TEM image of CK mixed micelles

圖2　CK混合膠束的粒徑分布圖Fig 2　Particle size distribution of CK mixed micelles

3.4CK混合膠束的溶解度

CK含量測定的回歸方程為A＝3.0408c+3.624（r2＝0.9993）；方法回收率為102.67%，日內、日間RSD均小于0.21%（n＝5），符合含量的測定要求。CK混合膠束、CK原料藥中CK的溶解度分別為468.69、469.21、469.72，35.21、35.17、35.24 μg/ml，平均值分別為（469.21±0.024）、（35.21±0.010）μg/ml，表明與CK原料藥比較，CK混合膠束的溶解度大大增加，可能與TPGS與大豆卵磷脂及藥物之間復雜的相互作用有關。

3.5CK混合膠束的體外釋放度

CK原料藥和CK混合膠束的體外釋放曲線見圖3。

圖3　CK原料藥和CK混合膠束的體外釋放曲線Fig 3　Drug release profiles of CK crude drug and CK mixed micelles in vitro

由圖3可知，CK原料藥在模擬腸液中釋放的速度更快，而CK混合膠束釋放的速度比較穩定。CK原料藥12 h時的累積釋放度就超過了70%，而CK混合膠束150 h時的累積釋放度僅（66.19±0.027）%。結果表明，CK混合膠束具有一個特定的、在體外釋放的緩釋效應，可能是由于CK的高親和力和膠束的疏水結構，使其從膠束粒子中低效釋放。

3.6Caco-2細胞轉運試驗結果

試驗前后Caco-2細胞的電阻未發生明顯變化，測得各細胞樣品溶液中跨膜電阻值RSD均小于5%（n＝3），表明原料藥和輔料均不影響Caco-2細胞的完整性。計算給藥4 h時CK混合膠束對Caco-2細胞轉運的影響，結果見表5。

表5　CK原料藥和CK混合膠束的細胞滲透性能（n＝3）Tab 5　Cell permeability of CK and CK mixed micelles（n＝3）

由表5顯示，與CK原料藥比較，CK混合膠束從A→B的Papp顯著增大（P＜0.05），從B→A的Papp顯著降低（P＜0.05），外排比率（PappB→A/PappA→B）顯著降低（P＜0.05）。可知，CK混合膠束能有效提高CK的吸收并在很大程度上抑制了其外排。

4　討論

混合膠束是疏水性藥物輸送的理想劑型，其具有芯-殼結構，難溶藥物可以在膠束的疏水內芯內溶解。因此，膠束是一種可以提高難溶性藥物療效的有效途徑。磷脂是兩性化合物和細胞膜的一個重要組成部分，維持著細胞膜的流動性使藥物更容易吸收；并且CK的C—OH可與磷脂形成氫鍵和TPGS的疏水性鏈段能聚合在核心，從而使親脂性藥物在生物介質中可形成有著疏水核心和親水界面的水溶性膠束。TPGS是一種非離子型表面活性劑，具有較好的親水性；與此同時，其作為一種天然的P-gP抑制劑，對于存在顯著P-gP外排的藥物，具有抑制外排的作用。對于本研究以TPGS和大豆卵磷脂為聯合載體的人參稀有皂苷CK混合膠束而言，載體TPGS有效抑制P-gP外排、大豆卵磷脂較好的生物相容性及藥物的芯-殼結構等幾方面的共同作用，使CK的溶出得到了有效改善，促進了其吸收。

本研究采用溶劑揮發法聯合使用輔料TPGS和大豆卵磷脂成功制備了CK混合膠束，大大提高了CK的最大溶解度，比CK原料藥的溶解度增加了12倍；并且制備得到的混合膠束粒徑小、均勻，可推測該膠束穩定易于吸收。在保持較好的包封率和載藥量的情況下，原料藥的細胞滲透性也顯著增加，且能夠緩慢地釋放藥物。因此混合膠束可以作為未來開發CK制劑的一個新的劑型，且本研究可以為CK口服制劑的開發提供一定的數據支撐。

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（編輯：鄒麗娟）

Formulation Optimization and in vitro Evaluation of Rare Ginsenoside Compound K Mixed Micelles

QIAN Wei1，YU Zhaohui2，ZHU Yunze1（1.Dept.of Pharmacy and Medical Equipment，Yangzhou Wutaishan Hospital of Jiangsu Province，Jiangsu Yangzhou 225003，China；2.College of Pharmacy，Nanjing University of TCM，Nanjing 210023，China）

OBJECTIVE：To optimize the formulation of rare ginsenoside Compound K（CK）mixed micelle，and to investigate its in vitro release and apparent permeability coefficients（Papp）.METHODS：Using soy lecithin and vitamin E polyethylene glycol 1 000 succinate（TPGS）as excipients，CK mixed micelle was prepared by solvent evaporation method.Using drug-loading amount，encapsulation efficiency and particle size as index，orthogonal test was adopted to optimize feeding amount，the ratio of granulesten to TPGS and hydration volume；the micelle prepared by optimal formulation was investigated in respects of form，particle size，drug-loading amount，encapsulation efficiency，solubility，in vitro release；Pappof colon adenocarcinoma Caco-2 cell model was also inspected.RESULTS：The optimal formulation was as follows as feeding amount 1.0 mg，the ratio of granulesten to TPGS 1∶1，hydration volume 10 ml.The mixed micelles were spherical or spheroidal；the average particle size was（110±2.69）nm，and drug-loading amount was（4.32±0.19）%，entrapment efficiency was（92.23±2.76）%，and average solubility was（469.21±0.024）μg/ml；150 h accumulative release rate was（66.19±0.027）%（n＝3）.Pappof CK crude drug and CK mixed micelle were 26.20 and 3.78（n＝6）.CONCLUSIONS：The optimized preparation technology is feasible，and CK mixed micelle is prepared successfully.

Rare ginsenoside Compound K；Mixed micelles；Orthogonal test；Formulation optimization；Colon adenocarcinoma Caco-2 cell

R943

A

1001-0408（2016）28-3988-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.31

＊藥師。研究方向：人參稀有皂苷。電話：0514-87207259。E-mail：yuzhaohui0415@126.com

（2015-12-20

2016-03-29）