銀杏葉提取物EGB761對AS家兔PON-1和ox-LDL的影響*

郭茂娟，索艷榮，曾文赟，楊琳，李虎虎，姜希娟

（天津中醫藥大學，天津　300193）

·實驗研究·

銀杏葉提取物EGB761對AS家兔PON-1和ox-LDL的影響*

郭茂娟，索艷榮，曾文赟，楊琳，李虎虎，姜希娟

（天津中醫藥大學，天津300193）

［目的］觀察銀杏葉提取物EGB761對動脈粥樣硬化家兔對氧磷酶-1（PON-1）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的影響。［方法］將24只日本大耳白兔隨機分為正常組、模型組、EGB761組（n=8）。正常組給予普通飲食，模型組和EGB761組高脂飲食10周。EGB761組從第7周起給予EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃4周，正常組和模型組給予等量生理鹽水。采用酶免疫吸附法（ELISA法）和生化法檢測PON-1的活性和含量，ELISA法檢測ox-LDL的含量。［結果］模型組PON-1活性和含量明顯降低（P＜0.05），ox-LDL的含量明顯升高，銀杏葉提取物組PON-1活性和含量明顯升高，ox-LDL明顯降低（P＜0.05）。［結論］銀杏葉提取物EGB761降低ox-LDL、抗動脈粥樣梗化（AS）的機制可能與其上調PON-1活性和含量有關。

銀杏葉提取物EGB761；對氧磷酶-1；氧化低密度脂蛋白；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（AS）是諸多心腦血管疾病的病理基礎，而血脂紊亂，尤其是低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）的升高是形成AS的物質基礎。當內皮細胞受損時，氧化應激增強，脂質過氧化，沉積于內膜下的LDL被氧化修飾成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL對內皮細胞具有細胞毒性作用，可損傷內皮，導致更多LDL沉積于內皮下，同時募集單核細胞侵入內皮并分化為巨噬細胞后吞噬ox-LDL，形成泡沫細胞，促進AS形成［1］。

對氧磷酶-1（PON-1）是一種由355個氨基酸組成的具有類似過氧化物酶活性的糖蛋白，廣泛存在于哺乳動物的肝、脾、腦等組織及血液中，尤以肝及血液中的活性較高［2］。其主要由肝臟合成，分泌入血后與高密度脂蛋白（HDL）表面的apoA-I緊密結合，保護HDL免受氧化修飾［3］。同時PON-1亦可水解芳香族羧酸酯類及脂質過氧化物，使LDL免受氧化修飾［4］。現代研究表明PON-1第283位的Cys是發揮抗LDL氧化修飾的關鍵基團［5］。

EGB761是從銀杏葉中分離純化的提取物，其主要成分是24%的銀杏黃酮苷和6%的萜烯內酯。近年來國內外研究均證實銀杏葉提取物EGB761具有明顯抗AS效應［6-7］，然而，其具體機制是否與調控PON-1活性及含量，進而抑制ox-LDL形成有關，還有待進一步深入研究。本文將從調控PON-1活性及含量入手，探討EGB761降低ox-LDL含量以發揮抗AS作用。

1　材料和方法

1.1藥品、試劑和儀器銀杏葉提取物（EGB761）（商品名：金納多），由德國威瑪舒培博士藥廠生產，生產批號：9840808。PON-1活力檢測試劑盒購置于上海鈺博生物科技有限公司。PON-1酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒、ox-LDL ELISA檢測試劑盒均購于上海雅吉生物科技有限公司。高脂飼料由2%膽固醇（購置于天津市英博生化試劑有限公司，含量純度＞98%）、10%金龍魚色拉油（市售）、88%普通飼料（由天津市武清區科達養殖中心提供）混合配成。儀器：離心機（CENCEL530），酶標儀（BIO-RAD）。

1.2實驗動物日本大耳白兔24只（購置于北京維通利華實驗動物技術有限公司），雄性，體質量（2.4±0.2）kg，飼養于天津中醫藥大學清潔級實驗動物中心。

1.3實驗分組及造模方法24只日本大耳白兔，于溫度（28±2）℃、濕度37%～48%的清潔級動物房適應性飼養1周后，隨機分為3組：正常組（n=8）給予普通兔飼料；模型組（n=8）和EGB761組（n=8）給予高脂飼料，自由飲水。

在高脂飼養6周后，EGB761組給予銀杏葉提取物EGB761 50 mg/（kg·d）灌胃4周，正常組和模型組則給予等量生理鹽水。

1.4樣本的獲取和處理10周后各組動物禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，經耳緣靜脈取血，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱凍存備用。

1.5指標檢測方法及步驟血清PON-1和ox-LDL含量的檢測參照ELISA試劑盒說明書。PON-1酶活力的檢測：以對氧磷為酶作用底物，依據酶學動力學原理，對其在405 nm處4 min內產物的生成速率進行連續監測，酶活性以每毫升血清每分鐘生成產物對硝基酚的納摩爾數表示1個PON-1酶活性單位值（單位U/mL）。

1.6統計學方法采用SPSS19.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較使用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1EGB761對PON-1含量和活性的影響見表1。

表1　EGB761對PON-1含量和活性的影響（±s）

表1　EGB761對PON-1含量和活性的影響（±s）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別nPON-1含量（ng/L）PON-1活性（U/mL）正常組8564.50±36.83102.00±16.08模型組8420.83±31.51**69.33±16.51** EGB761組8506.67±42.55##88.67±9.03#

由表1可以看出，與正常組相比模型組PON-1的含量和活性均明顯降低（P＜0.01）；而EGB761組與模型組相比，PON-1的含量（P＜0.01）及活性（P＜0.05）明顯提高。

2.2EGB761對ox-LDL含量的影響見表2。

表2　EGB761對ox-LDL含量的影響（±s）

表2　EGB761對ox-LDL含量的影響（±s）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

組別nox-LDL（μg/L）正常組8250.83±38.22模型組8630.50±136.02** EGB761組8480.83±51.31#

以上結果說明，模型組的ox-LDL含量明顯升高，與正常組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；而EGB761組與模型組相比，ox-LDL的含量明顯降低（P＜0.05）。

3　討論

AS的形成是一個復雜的過程，血脂紊亂、氧化應激、內皮功能失調、慢性炎癥反應等被認為是AS發生發展的重要因素。其中氧化應激參與并促進AS的發生、發展，在AS病程中發揮重要作用［8］。

流行病學調查顯示，引起AS的關鍵是氧化修飾性脂蛋白，尤其是血液中的LDL被活性氧（ROS）等自由基氧化后形成ox-LDL。ox-LDL作為氧化應激的特異性產物，在被氧化過程中，可以產生具有細胞毒性的溶血磷脂損傷內皮細胞，加速泡沫細胞形成，促進AS的病程進展［9］。

前期實驗［10］發現EGB761可以改變AS家兔的動脈粥樣斑塊形態，而本實驗研究發現經EGB761干預的AS家兔血清中的ox-LDL較模型組下調，提示EGB761可能通過干預LDL的氧化修飾防治AS。

PON-1具有過氧化物酶活性，血清中PON-1含量及活性的高低，反映了其抗脂質氧化的能力。血清中的PON-1與HDL上的ApoAⅠ具有很強的親和力，兩者結合后，可以使PON-1形成高穩定性和高活性的構型，從而使其內酯酶活性提高約20倍［11］。

這樣一方面，使HDL免于氧化修飾，提高了膽固醇的逆向轉運，另一方面，減少了LDL的氧化修飾，降低了溶血磷脂的產量，從而起到保護內皮，預防AS的目的［12］。相反，當AS發生時，PON-1的含量或活性下降，參與水解脂質過氧化的能力減弱，造成脂質過氧化物在血液中大量堆積，促進ox-LDL形成，后者損傷內皮，使脂質在內膜下大量沉積，進一步惡化AS［13］。

臨床研究也證實血清PON-1活性下降和ox-LDL水平升高與冠心病的發生及病情嚴重程度密切相關［14］。而PON-1活性下降和含量降低是ox-LDL水平升高的關鍵影響因素。本實驗結果顯示經高脂誘導復制的家兔AS模型，PON-1的活性及含量明顯降低，而經EGB761干預后，其活性與含量都顯著提高，此結果與伍海濤［15］的研究結果基本一致。

現代臨床和實驗對銀杏葉提取物保護神經元的研究頗多［16-19］，并主要集中在抗凋亡、抑制氧化應激等方面［20］。亦有研究從抗氧化損傷，抗炎癥角度發現EGB761對AS具有防治作用［21-23］，但目前關于探討EGB761在調節PON-1和ox-LDL兩者之間關系上，很少有相關報道。

本實驗采用EGB761干預高脂誘導的AS家兔模型發現其可以顯著降低AS家兔血清中ox-LDL的含量，并上調PON-1的活性及含量。將ox-LDL與PON-1聯系起來，提示EGB761可能通過上調PON-1酶的活性和含量，降低LDL的氧化修飾機率，從而降低ox-LDL水平，進而發揮抗AS的作用。

本文的研究結果只涉及到血清層面，并未涉及血管組織中ox-LDL的變化，以及具體的信號通路還有待進一步研究發現。

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Effects of EGB761 on PON-1 and ox-LDL in rabbits with atherosclerosis

GUO Mao-juan，SUO Yan-rong，ZENG Wen-yun，YANG Lin，LI Hu-hu，JIANG Xi-juan（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe effect of EGB761 on PON-1 and ox-LDL in rabbits with atherosclerosis.［Methods］Twenty-four Japanese white rabbits were randomly divided into normal group，model group and EGB761 group.Rabbits in normal group were fed with ordinary diet；model and EGB761 group were given high-fat diet for 10 weeks.Meanwhile，from the seventh week，rabbits in EGB761 group were given 50 mg/（kg·d）of EGB761，control group and model group were given normal saline for 4 weeks.Ten weeks later，the vitality and content of PON-1 were detected by Elisa and biochemical methods，the ox-LDL were detected by Elisa method.［Results］Compared with the model group，the vitality and content of PON1 in model group were higher（P＜0.05）and the ox-LDL levels were lower，while in EGB761 group the vitality and content of PON-1 increased significantly and ox-LDL decreased obviously（P＜0.05）.［Conclusion］The effect of EGB761 on reducing the level of ox-LDL in AS rabbits may response to raise the vitality and content of PON-1.

EGB761；PON-1；ox-LDL；AS

R285.5

A

1673-9043（2016）02-0095-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.02.07

國家自然科學基金項目（830472117，81202797）；天津市自然科學基金項目（08JCYBJC10800）。

郭茂娟（1980-），女，副教授，主要從事中醫藥防治心血管疾病的研究。

姜希娟，E-mail：xijuanjiang@foxmail.com。

（2015-11-28）