hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對MC3T3-E1細胞分化的影響①

阮 薔，趙 剛，肖 月，孫佳寧

(佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

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hBMP2修飾的β-TCP/膠原支架對MC3T3-E1細胞分化的影響①

阮 薔，趙 剛，肖 月，孫佳寧

(佳木斯大學口腔醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：構建含hBMP2(Human Bone morphogenetic proteins2，hBMP2)質粒DNA的β-TCP/膠原(β-Tricalcium Phosphate/Collagen β-TCP/膠原)支架材料，并研究其對MC3T3-E1細胞分化的影響。方法：制備納米級多孔β-TCP/膠原支架并負載含BMP2目的基因的質粒DNA形成基因修飾的支架材料。建立MC3T3-E1細胞株與復合支架的體外培養體系。將其分為支架組和平皿組，再根據質粒的不同濃度每組再分為4個小組。復合培養后取樣通過掃描電鏡和光鏡進行細胞形態學觀察；1、3、7、14dALP活性檢測測量細胞堿性磷酸酶的活性，1、3、7、14d茜素紅染色觀察，實時熒光定量PCR檢測細胞周期1、3、7、14d觀察Runx2、OCN、ALP、OPN因子,檢測結果處理并進行統計學分析。結果：含hBMP2為目的基因的質粒DNA修飾納米β-TCP/I型膠原溶液復合材料上細胞黏附數、分化數量及材料表面分布都高于單純含hBMP2為目的基因的質粒DNA，具有統計學意義(P<0.05)，通過用堿性磷酸酶活性ALP、茜素紅染色檢測結果顯示支架組對MC3T3-E1細胞成骨能力的影響優于平皿組，具有統計學意義(P<0.05)。結論：負載hBMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的生物相容性、優良的骨誘導性和骨傳導性，是一種理想的骨缺損修復材料。

BMP；β-TCP/膠原；分化；骨缺損

臨床上骨缺損是一種多發、常見而又治療相當復雜的先天性、發育性及后天性的疾患，不僅會給社會也會帶來沉重的經濟和醫療負擔，同時也導致患者非常嚴重的形態畸形和功能活動障礙。頜骨缺損修復一直是臨床治療中的難題[1]。伴隨著組織工程技術日益發展，支架材料復合成骨生長因子已經成為骨缺損修復一門新興技術。在種類相當繁多的的支架材料中，β磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate,β-TCP)是構成骨組織眾多無機物質中的一種，它具有良好的生物相容性，但是不少學者發現β-TCP大多數情況下組織的相容性尚可，但其生物的響應性-即受植區組織對其反應性遠遠不如自體的骨組織[2]。因此解決此類問題成為國內外學者們潛心鉆研論證的課題。實驗研究組在掌握了先進技術和提供專業材料的基礎上，評估檢測并論證具備微一納孔結構的TCP/膠原復合材料的生物相容性，課題組在預實驗階段已經成功制備了微一納孔結構的TCP/膠原復合材料。利用該支架材料的膠原成分作為質粒DNA載體進行體外實驗研究。從而研制出性能優異的骨缺損組織工程復合支架材料。本實驗將研究的主方向定位到新一代的成骨材料上。將具有骨傳導性能的支架與具有生物活性能的成骨因子進行復合，形成的復合支架材料以期同時具備骨傳導性和骨誘導性。

1 材料和方法

1.1 實驗設計與材料分組

實驗設計：體外細胞觀察性實驗研究。

時間及地點：自2015-03～2016-01于佳木斯大學基礎實驗室完成。

實驗材料分組：支架組：含hBMP-2為目的基因的質粒DNA修飾納米β-TCP/I型膠原溶液復 合材料，再分為4小組，每組質粒濃度分別為：Z0：0μg、Z14：14μg、Z29：29μg、Z43:43μg。平皿組：含hBMP-2為目的基因的質粒DNA，分為4小組，每組質粒濃度分別為：M0:0μg、M1:1μg、M2:2μg、M4:4 μg。

主要實驗儀器：層流超聲工作臺(上海博訊實業有限公司，中國)；電熱恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司)、超低溫冰箱(Thermo，美國)；電鏡日本島津(SSX-550)倒置顯微鏡(Olympus BX5，日本)；輔助電動移液槍、離心管、微量移液器( Brand，德國)；高速Megafuge離心機(美國Thermo Scientific)；渦旋離心機(美國Scientific instrument)。

1.2 實驗方法

①合成帶有hBMP2基因的質粒DNA，②負載hBMP-2為目的基因質粒DNA修飾納米β-TCP/I型膠原溶液復合材料，③MC3T3-E1細胞培養，④材料與細胞復合培養。

1.3 檢測方法與指標

1.3.1 形態學觀察：體外細胞樣品經過取材、固定、脫水等預先處理后，掃描電鏡、光鏡進行細胞形態學觀察。

1.3.2 堿性磷酸酶活性ALP檢測：成骨誘導液由完全培養基中加入地塞米松1×10-8M(sigma,Germany)、β-甘油磷酸鈉10mM(sigma,Germany)、維生素C 50μg/mL(華潤雙鶴藥業，中國)配制而成。將平皿與支架上成骨誘導1d、3d、7d、14d的細胞用預冷的PBS洗兩遍，胰酶消化后離心去上清，加入100μL 0.1% triton X-100(Amresco,USA)，打散細胞后4℃放置6h，離心取上清。根據堿性磷酸酶測試盒說明書(南京建成，中國)對堿性磷酸酶活性進測定。

1.3.3 茜素紅染色檢測鈣結節：24孔板培養細胞， 成骨誘導14f。0.1%茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)溶液配制。取1g Tris 溶于100mL三蒸水，使用 HCL 緩慢滴加與上述溶液中調定pH值于8.3，再加入0.1g茜素紅，現用現配。

①吸出培養基后,用PBS清洗3遍。②4%多聚甲醛固定30min。③雙蒸水清洗2遍，每孔加入500μL0.5%茜素紅染液，避光室溫放置1h。④吸出茜素紅染液，雙蒸水清洗2遍。大體和顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 形態學觀察

支架電鏡圖：含人BMP2質粒DNA修飾的納米級β-磷酸三鈣/I型膠原復合材料的掃描電鏡下觀察形態，見圖1。顯示復合材料的表面上有大量大小不一的孔隙。

2.2 堿性磷酸酶ALP活性檢測

將成骨細胞分別接種在平皿和支架材料的表面，在誘導后的1d、3d、7d、14d對成骨細胞中ALP的活性進行檢測，發現在成骨誘導過程中ALP表達呈現升高的趨勢，在成骨細胞接種早期(1、3天)，ALP分泌的量很少，在各組間差異不是很顯著，從第7天起，接種于支架材料的成骨細胞分泌的ALP開始增加明顯且高于平皿組，并且在平皿培養的細胞中轉染BMP2可促進ALP的表達，見圖2。

圖1 掃描電鏡下的形態(標尺：100μm)

圖2 ALP活性檢測

2.3 茜素紅染色檢測鈣結節

小鼠前成骨細胞在成骨誘導第1天，第3天，第7天，第14天后，分別進行茜素紅染色，在第一天，第3天對照結果不是很顯著，第7天，14d后，茜素紅結果顯示平皿組可見略有結節突起成微紅色，見圖3，支架組能明顯觀察到突起的結節，鈣結節著色較平皿組深，呈橘色，數量較多。見圖4。

圖3 A平皿組茜素紅染色 圖4 B支架組茜素紅染色

2.4 實時熒光定量PCR檢測細胞成骨相關基因表達

MC3T3-E1細胞在成骨誘導1d、3d、7d、14d后,支架組Runx2、OCN表達量均明顯高于平皿組,其中支架組Runx2、OCN、ALP、OPN 有顯著性差異(P<0.05)。圖5結果表明,復合支架材料由于摻入了具有生物活性的質粒,在一定時期內提高了成骨細胞的相關基因表達水平。據此,我們推測該類材料的成骨活性主要通過影響和調控成骨基因的表達,從而促進成骨細胞的生長、分化和骨基質形成。

3 討論

頜骨缺損的治療一直以來是臨床上得熱點，近年來骨組織工程的迅速發展為頜骨缺損治療提供了一條新的途徑[3]。以往的骨組織工程研究中，常將礦化物質骨模型、膠原和藻酸鹽混合固態多孔的羥磷灰石、殼聚糖、磷酸鈣和聚合物作為支架材料來促進頜骨組織再生。但是這些支架材料容易引起動物的免疫原性，可再生數量和保質期受限，且功能不顯著，因此很少用于臨床研究[4]。

圖5 RT-PCR檢測

理想的骨缺損的修復材料應具備優良的骨誘導活性[5，6]。hBMP-2可以誘導成骨前體細胞分化為成骨細胞.它不僅對定向性成骨前體細胞有促進分化的作用,還可使可誘導的成骨前體細胞,如人皮膚成纖維細胞及成肌細胞分化為成骨細胞[7]，大量研究已證實BMP-2具有最強的骨誘導能力[8]。因此本實驗采用局部基因治療的方法將編碼BMP-2基因的質粒DNA負載到納米級多孔β-TCP/膠原支架材料植入體內后，支架緩釋BMP-2 DNA，轉染細胞并持續表達BMP-2。

隨著再生醫學的迅猛發展以及分子生物學技術在骨再生研究中的廣泛應用，研究骨修復材料與成骨細胞及宿主間的相互作用成為當前骨再生醫學的研究重點與熱點[9]。大量的研究表明高濃縮成骨基因聚合物包裹DNA支架在體內和體外均具有良好的生物學效應[10]。

綜上所述，負載BMP2基因修飾的β-TCP/膠原支架材料具有良好的生物相容性、優良的骨誘導性和骨傳導性，具有良好的臨床應用前景，是一種理想的骨缺損修復材料?？梢詰糜诳谇环N植修復、口腔頜面外科及其與口腔正畸聯合修復骨缺損治療中。

[1]劉星綱，翁文劍，鄧旭亮，等.納米 -磷酸三鈣/膠原復合體修復兔頜骨缺損的研究[J].口腔醫學，2005，(4)：196-198

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[3]Gugala Z,Davis AR,Fouletier-Dilling CM,et al.Adenovirus BMP2-induced osteogenesis in combination with collagen carriers[J].Biomaterials,2012,28(30):4469-4479

[4]段峰,栗秋,趙剛.人參皂苷Rg1對MC3T3-E1成骨細胞增殖分化的相關研究[J].黑龍江醫藥科學,2016,39(1):94-95

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RUANQiang,ZHAOGang,XIAOYue,SUNJia-ning

(Dental College Jiamusi University,Jiamusi 154003,China)

Objective:To build containing hBMP2(Human Bone morphogenetic proteins2，hBMP2) plasmid DNA β-TCP(β-Tricalcium Phosphate/Collagen β-TCP)/collagen scaffold material,and to study its effect on the differentiation ability of MC3T3-E1 cells.Methods:The nanoscale porous β-TCP/collagen/collagen scaffold loaded by BMP2 gene plasmid DNA genetic modification of scaffold materials was prepared.MC3T3-E1 cells lines and composite scaffolds in vitro culture system was established.It can be divided into stent group and dish group.According to different concentration of plasmid,each group could be also divided into four groups.The sample cell morphology was selected after compound training by scanning electron microscope and light microscope for further observation.1,3,7,14 days activity detection measurement cells the activity of alkaline Phosph-atase 1,3,7,14 days observe the alizarin red staining.Test results were processed and statistically analyzed.Results：For the purpose gene plasmid DNA containing hBMP2 modified nano beta TCP/solutions of type I collagen composite cells adhesion number,quantity and distribution of material surface is higher than that of pure containing hBMP -2 for the purpose gene plasmid DNA (P<0.05).By using alkaline phosphatase activity of ALP,and Alizarin red staining,the test results show that the stent group of cells of MC3T3 -E1 osteogenesis ability than the influence of the dish group.Conclusion：We conclude that porous β-TCP/collagen scaffold loaded with BMP2 DNA is an appropriate candidate for bone defect repair material .

BMP2；β-TCP/collagen；differentiation；bone defect

1.黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201487；2.佳木斯大學研究生創新項目，編號：LZR2015_015。

阮薔(1988～)女，內蒙古包頭人，在讀碩士研究生。

趙剛(1975～)男，黑龍江依蘭人，碩士，碩士研究生導師，副教授。E-mail：13504545575@126.com。

Q254

A

1008-0104(2016)05-0005-03

2016-05-07)The evaluation of β tricalcium phosphate/collagen scaffold modified by human bone morphogenetic proteins 2 plasmid on the differentiation of MC3T3-E1