鋰—匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的Caspase-3的變化及靈芝酸的干預①

程 瑤，金玉玲， 秦麗紅，王 辰，劉 蕾

(佳木斯大學附屬第一醫院神經科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

鋰—匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的Caspase-3的變化及靈芝酸的干預①

程 瑤，金玉玲， 秦麗紅，王 辰，劉 蕾

(佳木斯大學附屬第一醫院神經科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察靈芝酸對氯化鋰-匹魯卡品致癇鼠海馬神經元Caspase-3蛋白的表達情況，探討靈芝酸是否具有抗癇作用及機制。方法：選取雄性SD大鼠60只，隨機分為4組(n=15)，A組：生理鹽水對照組，B組：癲癇模型組，C組：靈芝酸干預組，D組：二甲基亞砜(DMSO)對照組。每組給予相應藥后，對大鼠進行行為學觀察、HE染色法檢測海馬神經元細胞形態學變化，免疫組化法檢測各組大鼠海馬區Caspase-3蛋白表達。結果：與A組相比，B、C、D組Caspase-3的表達量相對較高(P<0.01)；靈芝酸干預后，C、D組Caspase-3的表達量明顯低于B組表達(P < 0.05)。結論：靈芝酸可通過影響 Caspase-3 的表達量抑制凋亡的發生，對癲癇大鼠海馬神經元起到保護作用。

靈芝酸；癲癇；Caspase-3

癲癇是一種常見的神經系統功能紊亂性疾病，主要是由于大腦一過性放電引起的發作性意識喪失[1，2]，海馬、大腦皮質等邊緣神經元的損傷是其病理基礎。靈芝酸是由Kubota[3]在上世紀80年代首次從靈芝中分離并提純，并具有多樣性生物學活性，在臨床上可以防治多種疾病。目前靈芝酸干預癲癇疾病方面研究的相關報道少見。本實驗主要通過向致癇大鼠腹腔注射靈芝酸干預后，觀察大鼠海馬區表達的Caspase-3蛋白，通過實驗數據結果推測靈芝酸對癲癇保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠來源佳木斯大學動物實驗中心；靈芝酸購買于大連美侖生物技術有限公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(武漢博士德公司)；Caspase-3抗體(美國Santa Cruz生物技術公司)；BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與給藥

60只體重(180±20)g健康雄性SD大鼠，隨機分為4組(n=15)，A組：生理鹽水對照組，腹腔注射生理鹽水(與氯化鋰等量)，20h后腹腔注射生理鹽水(與靈芝酸等量)，30min后腹腔注射生理鹽水(與硫酸阿托品等量)，30min后腹腔注射生理鹽水(與匹魯卡品等量)。B：癲癇模型組，氯化鋰(3mmol/kg)腹腔注射，20h后予以與靈芝酸等量的生理鹽水腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(80mg/kg)腹腔注射，C：靈芝酸干預組，腹腔注射氯化鋰(3mmol/kg)，20h后予以靈芝酸(10mg/kg)腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(80mg/kg)腹腔注射； D組：二甲基亞砜(DMSO)對照組，首先予以氯化鋰(3mmol/kg)腹腔注射，20h后予以靈芝酸(10mg/kg)腹腔注射，60min后予以匹魯卡品(30mg/kg)腹腔注射。靈芝酸注射前60min予以腹腔注射DMSO(0.5mg/kg)。為了對抗匹魯卡品導致的外周膽堿能反應，除A組外其他各組在匹魯卡品腹腔注射前30min均給予皮下注射硫酸阿托品(1mg/kg)。

造模成功標準：大鼠在注射匹魯卡品后如出現Ⅳ級以上發作同時伴有全身性驚厥者持續30min以上。癲癇發作1h后腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)終止發作。取材時間為癲癇發作終止后6h。

1.2.2 海馬組織病理學觀察

(1)HE染色：取海馬組織蠟塊標本切片經常規脫水、透明、浸蠟、包埋、蘇木素-伊紅染色，高倍鏡視野觀察(隨機選取5個)。(2) 免疫組織化學染色：海馬組織蠟塊標本切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、抗原熱修復處理后滴加5%BSA封閉液，在37℃環境下，孵育20min，在4℃環境下加入Caspase-3一抗過夜，于第二天加入二抗、SABC、DAB顯色劑，蘇木素輕度復染，陰性對照用PBS代替一抗。觀察海馬神經細胞中Caspase-3蛋白于光鏡下。隨機從每個標本中取3張切片，后隨機取5個不重復的視野于每張切片中，分別記數染色的陽性細胞，標本結果以這3張切片陽性細胞數的平均值表示，實驗結果以每組5例樣本觀察結果的平均值表示。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理，P<0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠行為學觀察

癲癇發作情況基本均達到Ⅳ～V級。表現為四肢及面部震攣，節律性點頭、甩尾，繼之全身強直陣攣抽搐或站立不能和跌倒，實驗過程中死亡大鼠15只，隨機替換補充。

2.2 HE染色結果

可見A組大鼠海馬神經元細胞形態正常，分布呈多層樣，排列緊密，胞體呈圓形或橢圓形，細胞樹突稠密；B組大鼠海馬CA1區及CA3區神經元細胞數目較A組明顯減少，核固縮，排列紊亂，胞體變小甚至破裂。B組海馬神經元損傷程度較C、D組重。見圖1。

圖1 海馬CA1區神經元(HE，200×)

2.3 免疫組化結果

在胞漿中有蛋白的表達，很少量的表達在胞膜與胞核。A組胞漿中可見很少量的棕黃色顆粒(圖2)。由表1可見，其余三組中Caspase-3的陽性細胞數均顯著多于A組，胞核中偶見棕黃色顆粒，差異具有統計學意義(P<0.01)。C組、D組中兩種蛋白的陽性細胞數明顯比B組減少，差異具有統計學意義(P<0.05)。C組中蛋白的陽性細胞數雖少于D組，但差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 海馬CA1區Caspase-3蛋白(SABC，200×)

組別Caspase-3A組(NS)23.51±1.19B組(Pilo+NS)56.98±4.99#C組(Pilo+靈芝酸)28.40±2.29#*D組(Pilo+DMSO+靈芝酸)35.29±4.87#*

注：#B、C、D組與A組相比P<0.01；*C、D組與B組相比P<0.05。

3 討論

現如今，醫學界對癲癇患者給予越來越多的關注，進行相關的評價，制定相應治療方案，對于提高癲癇患者生活質量具有重要意義。近年的研究認為，Caspase家族的激活在癲癇后神經元的損傷中發揮重要作用，同時其蛋白酶級聯反應又參與復雜的凋亡過程。Caspase-3就是直接介導凋亡的效應者之一。Caspase-3就是直接介導凋亡的效應者之一。觀測致癇鼠海馬神經元細胞時發現，其損傷的神經元細胞具有典型的凋亡特征，而Caspase-3的活化又與這種凋亡關系密切，其抑制劑可以減輕這種損傷[4～6]。本實驗中我們所應用的靈芝酸是靈芝中一種具有生物活性的三萜類物質[7]，此物質具有鎮靜、止痛、抗腫瘤、抑制炎癥反應、保肝護肝和抗衰老、調節人體糖代謝等作用[8～13]，對海馬神經元的保護作用是通過降低致癇鼠海馬神經元中ERK1/2的磷酸化水平達到目的[14]。本實驗中鋰-匹魯卡品導致的大鼠癲癇后Caspase-3蛋白表達量增高，而在給予靈芝酸后，可明顯減低此蛋白的表達量，說明此藥物能夠抑制Caspase-3介導的神經元細胞凋亡，改善癲癇灶微環境，為臨床改善癲癇發作提供了實驗理論依據，也為抗癲癇藥物的研究提供了新的方向。

[1]IE Leppik.Wanted：a global campaign against epilepsy [J].The Lancet，2012，380(9848)：1121

[2]Nadler JV.The recurrent mossy fiber pathway of the epileptic brain[J].Neurochem Res，2003，28(11)：1649-1658

[3]Kubota T,Asaka Y,Miura I,et a1.Structures of ganoderic acid A and B,two lanostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum (Fr.) Karst[J].Helv Chim Acta，1982，65(2)：611-619

[4]郭小明.Caspase-3與癲癇神經元損傷[J].中國康復理論與實踐，2004，5：34-35

[5]NA Thornberry.Y Lazebnik Caspases:Enemies Within [J].Science,1998,281(5381):1312-1316

[6]Zhang Lx.Apotosis of hippocampal neurons after amygdala kindled seizures [J].Brain Res Mol Brain Res，1998，55(2)：198-208

[7]蔣麗，黃遠英，殷光玲.靈芝孢子油免疫調節作用的研究[J].現代食品科技，2013，29(3)：531-533

[8]王淑秋，邸偉華，馬小茹，等.戊四氮(PTZ)致癇大鼠腦組織NO和NOS變化及靈芝抱子粉干預[J].黑龍江醫藥科學，2011，34(4):79-80

[9]RR Leker，F Soldner，DJ Hoeppner，et al.Notch ignalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo[J].Nature,2006，442(7104):823-826

[10]CE Murry，RB Jennings，KA Reimer .Preconditioning with ischemia :a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation，1986，74(5):1124-1136

[11]李仲娟，楊朝令，楊細鳳，等.靈芝酸G對FcεRIα肥大細胞的活性影響[J].時珍國醫國藥，2014，25(9)：2101-2102

[12]王健，楊元帥，王鋼，等.靈芝酸抗癌機制的分子模擬研究[J].沈陽藥科大學學報，2012，29(11)：887-892

[13]金德寬.靈芝酸對人體糖代謝調節作用的研究[J].食品研究與開發，2012，33(11)：202-207

[14]欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫藥科學，2014，37(2)：1-3

黑龍江省教育廳資助項目，編號：12521543。

程瑤(1988～)女，黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

金玉玲(1969～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：754167691@qq.com。

R285.5

A

1008-0104(2016)05-0008-02

2016-05-04)