中藥對(duì)大鼠肝纖維化MMP-13及α-SMA的影響①

盧鳳美，林昔，劉東璞，徐霄航，孟慶媛，盛延良，姚海濤

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

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中藥對(duì)大鼠肝纖維化MMP-13及α-SMA的影響①

盧鳳美1，林昔1，劉東璞1，徐霄航2，孟慶媛1，盛延良1，姚海濤1

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

目的:探討中藥紅景天、大黃酸(Rhein 1,8-二羥基-3-羧基蒽醌)對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型肝組織中MMP-13及α-SMA的表達(dá)的影響。方法:本實(shí)驗(yàn)用四氯化碳誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型。健康♂SD大鼠70只，隨機(jī)分組：(1)對(duì)照組(10只)；(2)模型組(20只)；(3)干預(yù)組1(大黃酸組，20只)；(4)干預(yù)組2(紅景天組，20只)。于實(shí)驗(yàn)8周后處死大鼠取肝組織檢測(cè)MMP-13mRNA、α-SMAmRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:紅景天、大黃酸干預(yù)組肝組織中MMP-13mRNA及蛋白陽(yáng)性表達(dá)均高于模型組(P<0.05)；紅景天、大黃酸干預(yù)組肝組織中α-SMAmRNA及蛋白陽(yáng)性表達(dá)均低于模型組(P<0.05)；肝組織MMP-13mRNA表達(dá)與α-SMAmRNA表達(dá)水平變化呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:中藥紅景天與大黃酸均能有效促進(jìn)肝纖維化大鼠肝臟中MMP-13、抑制α-SMA表達(dá)；中藥大黃酸和紅景天都能保護(hù)肝細(xì)胞活性,促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)再生，具有抗肝纖維化作用。

紅景天；大黃酸 ；MMP-13； α-SMA

近年來肝病已是威脅我國(guó)百姓健康的一大殺手。肝病中肝纖維化是肝硬化、肝癌等的必由之路，因此對(duì)肝纖維化的治療和逆轉(zhuǎn)是治療肝病的重要環(huán)節(jié)。復(fù)方紅景天對(duì)肝纖維化的治療報(bào)道較多，同時(shí)對(duì)肝纖維化肝組織內(nèi)相關(guān)成分表達(dá)情況的影響也有各案報(bào)道[1～2]，肝臟纖維化的病理生理學(xué)發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜,首先，肝細(xì)胞在各種損傷性因素作用下受損發(fā)生變性、壞死合并炎癥反應(yīng),使肝竇內(nèi)的枯否細(xì)胞活化釋放大量的細(xì)胞因子,進(jìn)而激活Diss腔內(nèi)貯脂細(xì)胞,使之發(fā)生功能轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞,表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增生沉積,降解減少,形成肝纖維化，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal proteases,MMPs)[3～7]是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類，金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metal protease,TIMPs)則通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性抑制肝星狀細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解的雙重作用致肝纖維化。

本研究旨在觀察中藥紅景天、大黃酸對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟膠原沉積的影響，用免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)方法研究大鼠肝纖維化在紅景天和大黃酸干預(yù)下對(duì)α-SMA及MMP-13表達(dá)的影響,分析不同組別間α-SMA及MMP-13 表達(dá)差異的意義,了解其對(duì)大鼠肝臟α-SMA及MMP-13基因表達(dá)的影響，對(duì)比二者抗肝纖維化作用的療效。進(jìn)一步從分子水平和蛋白水平探討紅景天和大黃酸干預(yù)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重185～240g的健康♂SD大鼠70只,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

CCl4購(gòu)于廣州化學(xué)試劑三廠,紅景天膠囊購(gòu)自廣東長(zhǎng)興科技尊然健康管理有限公司，大黃酸粉劑購(gòu)自西安昊軒生物有限公司。RT-PCR試劑盒(大連寶生物生物工程有限公司),α-SMA及MMP-13免疫組化試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3 方法設(shè)計(jì)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康♂SD大鼠70只，隨機(jī)分組:(1)對(duì)照組(10只)生理鹽水灌胃+橄欖油腹腔注射；(2)模型組(20只)用CCl4ip法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,即用100mL/L CCl4(橄欖油稀釋)1mL/kg,1次/周,同時(shí)給予生理鹽水灌胃2次/周，共8周；(3)干預(yù)組1(20只)在造模同時(shí)給予大黃酸灌胃(50μg/kg，2次/周，共8周)；(4)干預(yù)組2(20只)在造模的同時(shí)給予紅景天灌胃(濃度40g/L,劑量10mL/kg,2次/周,共8周)。在造模的同時(shí)給予紅景天灌胃(濃度40g/L,劑量10mL/kg,2次/周,共8周)。各組間暴露因素?zé)o差別(P>0.05)。各組大鼠在最后一次CCl4腹腔注射給藥后48h處死,取新鮮肝組織迅速放到-80℃冰箱凍存，其余肝臟用福爾馬林固定,留做病理檢材。(試驗(yàn)中CCl4、紅景天劑量均在前期試驗(yàn)中探索出最佳劑量)[8]。

1.3.2 檢測(cè)方法

①常規(guī)石蠟切片肝纖維化造模檢測(cè)。②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織MMP-13、α-SMA表達(dá)。按試劑盒說明書操作。③RT-PCR檢測(cè)肝組織MMP-13、α-SMAmRNA:MMP-13 360bp S:5，-TATAGCAACAATTCTGGCG-3,；A:5,-CTGGTGGTGAAGAGCCAC-3,α-SMA 101Bp S:5，-AAGAGGAAGACAGCACAGCTC-3,；A:5,-GATGGATG-GGAAAACAGCC-3,按PCR試劑盒說明操作β-actin作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)病理主任醫(yī)師診斷80%(16/20)模型組大鼠肝纖維化為3期以上，20%(4/20)纖維化程度超過2期。干預(yù)組1(大黃酸)和干預(yù)組2(紅景天)肝纖維化程度均較模型組輕。

2.2 MMP-13、α-SMA免疫組化:大鼠肝組織MMP-13、α-SMA表達(dá)：模型組大鼠較正常組肝組織MMP-13蛋白的水平顯著降低(P<0.05)；干預(yù)組1與干預(yù)組2大鼠肝組織中MMP-13蛋白的水平較模型組顯著增高(P<0.05，表1，圖1)。干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)的變化在正常組織切片中呈微弱水平表達(dá),陽(yáng)性信號(hào)主要見于竇周間隙中。模型組較對(duì)照組肝組織α-SMA蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng),以竇周間隙中胞漿陽(yáng)性表達(dá)最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)組1、干預(yù)組2比較模型組大鼠肝組織中α-SMA蛋白的水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2。兩中藥干預(yù)組(干預(yù)組1與干預(yù)組2)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A B C D

圖1 肝組織中MMP-13表達(dá) A 正常對(duì)照組 B 模型組 C 紅景天干預(yù)組D大黃酸干預(yù)組

A B C D

表1 肝組織MMP-13、α-SMA表達(dá)的變化

注：aP<0.05vs模型組;a1P<0.05vs模型組;a2P<0.05vs模型組;P>0.05a1vsa2。

2.3 RT-PCR結(jié)果：模型組大鼠肝組織MMP-13mRNA的水平較正常組顯著降低(P<0.05)；干預(yù)組1與干預(yù)組2大鼠肝組織中MMP-13mRNA的水平較模型組顯著增高(P<0.05，表2) 干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組較對(duì)照組大鼠肝組織α-SMAmRNA的水平顯著增高(P<0.05)；干預(yù)組1、干預(yù)組2大鼠肝組織中α-SMAmRNA的水平較模型組低，其A值相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。干預(yù)組1與干預(yù)組2兩組間比較差別不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 肝組織MMP-13mRNA、α-SMAmRNA表達(dá)的變化

注：aP<0.05vs模型組;a1P<0.05vs模型組;a2P<0.05vs模型組;P>0.05a1vs a2。

3 討論

由于各種損傷性因素的作用，肝臟細(xì)胞受到損傷時(shí)，活化了處于靜止?fàn)顟B(tài)的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(EMC Ⅰ、Ⅱ型膠原)，同時(shí)產(chǎn)生大量抑制纖維化因子如間質(zhì)金屬蛋白酶-2( matrix metalloproteinases-2，MMP-2)及促纖維化因子如金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)等，在肝纖維化時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，大量沉積,同時(shí)肝臟的原有結(jié)構(gòu)被破壞[4]。MMP-13可以抑制肝纖維化的發(fā)生，降解EMC。肝星狀細(xì)胞活化，MMP-13/α-SMA比值降低，細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)降解減少,肝組織內(nèi)Ⅰ、Ⅱ型膠原沉積增多,進(jìn)而加劇肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，MMP-13/α-SMA對(duì)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用[9]。

通過多年的基礎(chǔ)與臨床研證實(shí)中藥紅景天具有從多層次多靶位抗肝纖維化作用的特點(diǎn)[10,11]。紅景天對(duì)大鼠肝纖維化模型的治療效果前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),同時(shí)二者之間存在一定的劑量關(guān)系，其治療肝纖維化的機(jī)制可能是紅景天能有效保護(hù)肝臟細(xì)胞，增加MMP-13蛋白及mRNA的表達(dá),降低肝纖溶顆粒可明顯降低大鼠肝臟α-SMA表達(dá)及mRNA的表達(dá)，上調(diào)MMP-13/α-SMA比值。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趯?duì)比大黃酸與紅景天在抗肝纖維化方面的作用。結(jié)果顯示經(jīng)大黃酸和紅景天干預(yù)組，病理切片組織學(xué)觀察大鼠肝細(xì)胞的變性、壞死以及炎癥反應(yīng)均較模型組減輕，門管區(qū)及中央靜脈周圍的纖維化程度明顯減輕，免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示干預(yù)組MMP-13表達(dá)較模型組增高，α-SMA表達(dá)較模型組下降，證明大黃酸和紅景天同樣具有較好的抗纖維化作用，大黃酸具有良好的抗氧化和抗炎的作用，因而可有效保護(hù)肝細(xì)胞，減輕肝臟損傷，抑制肝臟星狀細(xì)胞活化，上調(diào)MMP-13/α-SMA比值從而增加膠原降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)分泌，有效抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

[1]劉東璞,盧鳳美，孟慶媛，等.紅景天對(duì)大鼠肝纖維化肝臟中TIMP-1、Smad4表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，,32(12)：2556-2558

[2]盧鳳美,劉東璞，郭夢(mèng)凡.紅景天對(duì)大鼠肝纖維化肝臟中Smad4、Smad7表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2013,33(6)：1314-1316

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1.佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào):S2013-036;2.佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào):S2014-001。

盧鳳美(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副教授。

劉東璞(1969～)男，黑龍江佳木斯人，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liudongpu1220@163.com。

R285.5；R575.2

A

1008-0104(2016)05-0046-02

2016-05-18)