鹿源大腸桿菌ESBLs基因型檢測與分析

馮 濤 王曉菲 劉偉石 薛 原

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

鹿源大腸桿菌ESBLs基因型檢測與分析

馮 濤 王曉菲 劉偉石 薛 原*

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

ESBLs；

(College of Wildlife Resources，Northeast Forest University，Harbin ，150040，China)

超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是由質粒介導的能使細菌對三代頭孢菌素類、單酰胺類及青霉素類耐藥的一類酶，可在菌株間轉移或傳播。由于編碼β-內酰胺酶的基因多數存在于細菌體內可轉移的質粒上，使得耐藥基因可以在細菌之間通過接合和轉化等方式進行水平傳播，導致耐藥菌的廣泛傳播，嚴重影響了β-內酰胺類抗生素的治療效果，成為獸醫臨床面臨的嚴重問題[1]。ESBLs細菌攜帶的質粒可能帶有對喹諾酮、氨基糖苷類和磺胺類等藥物的多種耐藥基因，使其具有多重耐藥表型，嚴重影響臨床治療的效果。

ESBLs根據基因同源性的不同，目前可分為5類：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他類型等[2-3]。本研究旨在對東北地區臨床分離的150株鹿源大腸桿菌進行ESBLs 產生情況及基因型檢測，這將有助于明確菌株耐藥基因潛在的播散趨勢，有效監控細菌耐藥性。調查東北地區鹿源大腸桿菌ESBLs 流行基因型，為闡明鹿源大腸桿菌耐藥與產酶關系奠定基礎，并為指導獸醫臨床合理用藥提供依據。

1 材料

1.1 菌株

質控菌：大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所；臨床菌株：來源于東北地區的養鹿場。

1.2 藥品

氨芐西林(AMP)、阿莫西林(AMX)、頭孢噻吩(KF)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CRO)、阿莫西林/棒酸(AMC)、亞胺培南(IPM)、氨曲南(ATM)、慶大霉素(CN)、卡那霉素(K)、新霉素(NEO)、阿米卡星(AK)、諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFX)、四環素(TE)、強力霉素(DO)、氯霉素(C)、復方新諾明(SXT)、多粘菌素B(PB)，購自杭州天和微生物試劑有限公司；頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)和頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)，購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

1.3 主要儀器和試劑

質粒小量提取試劑盒，北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；DNA 片段凝膠回收試劑盒，愛思進生物技術有限責任公司產品；DL5000 DNAladder、taq酶大連寶生物工程有限公產品；DYY-12型多用電泳儀、水平微型電泳槽，北京市六一儀器廠產品；凝膠成相分析系統，美國Alpha Imager 2200公司產品；YEAR 2000 PCR儀，德國Biometra公司產品；3K30 高速冷凍離心機，美國SIGMA 公司產品。

2 方法

2.1 ESBLs檢測

按CLSI標準(抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準)操作和判斷。采用K-B紙片法進行藥敏實驗。

2.2 ESBLs確證實驗

2.2.1 初步篩選實驗

可悲的是，當一個人如日中天的時候，誰會去想居安思危？“安”的時候不會想到“危”，“安”的時候也不相信有“危”。三十年河東三十年河西，就是對不懂得居安思危的人的懲罰。

以紙片擴散法對受試菌抗藥性進行初篩試驗，結果判定標準CAZ≤22 mm，CRO ≤25 mm，CTX≤27 mm，ATM≤27 mm者為產生ESBLs。以大腸桿菌ATCC25922作陰性對照。

2.2.2 表型確證試驗

將受試菌均勻涂布于M-H 瓊脂平板，貼CAZ、CAZ/Clav 和CTX、CTX/Clav 兩組紙片，37℃培養16 h，如兩組中任一組加克拉維酸比不加克拉維酸抑菌圈直徑≥5 mm，可確認為產ESBLs 菌株。

2.3 ESBLs 基因的PCR 擴增及序列分析比較

2.3.1 引物的設計與合成

按照參考文獻[4]設計合成引物，引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。CTX-M產物長度為905 bp，TEM產物長度為717 bp，SHV產物長度為593 bp，OXA產物長度為198 bp。

2.3.2 PCR擴增模板的制備

將150 株鹿源大腸桿菌接種于的LB 瓊脂平板過夜培養后，挑取單個菌落接種于LB 肉湯中，37℃搖床培育12 h，用按吸附柱式質粒小量抽提試劑盒說明提取質粒DNA。

2.3.3 不同型別ESBLs基因的PCR檢測

反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，退火1 min，退火溫度56.5℃，72℃延伸1 min，從第二步開始共30個循環，72℃延伸5 min。

3 結果

3.1 ESBLs檢測結果

各藥對質控菌的抑菌圈均符合CISI 規定的標準。150株鹿大腸桿菌ESBLs檢測結果表明，在初篩試驗中，有84株大腸桿菌檢測為疑似產ESBLs 菌株。經確證試驗，84株疑似菌株中均為產ESBLs菌株，檢出率為56%(84/150)。

3.2 SHV、CTX-M、TEM 、OXA基因的檢測結果

以150株臨床分離的鹿源大腸桿菌的質粒DNA為模板進行SHV、CTX-M、TEM、OXA基因檢測，結果發現SHV、CTX-M、TEM、OXA擴增均為陽性，擴增片段大小與預期目的片段相符(圖1、2、3、4)。TEM基因PCR擴增陽性例數為35例，陽性率為23.33%；CTX-M基因檢出的陽性例數為5例，陽性率為3.33%；SHV基因檢出的陽性例數為38例，陽性率為25.33%；OXA基因檢出的陽性例數為12例，陽性率為8%。

圖1 CTX-M基因PCR擴增結果A-F CTX-M基因 Marker 2kbFig.1 PCR amplification product of CTX-M gene

圖2 TEM基因PCR擴增結果A-F TEM基因 Marker 2kbFig.2 PCR amplification product of TEM gene

圖3 SHV基因PCR擴增結果A-F SHV基因 Marker 5kbFig.3 PCR amplification product of SHV gene

圖4 OXA基因PCR擴增結果A-E OXA基因 Marker 5kbFig.4 PCR amplification product of OXA gene

3.3 藥敏實驗結果

不同藥物對150株鹿大腸桿菌耐藥率見圖5。84株產酶菌的耐藥率均比66株不產酶菌高。

圖5 150 株鹿源大腸桿菌對抗菌藥的藥敏試驗及耐藥率Fig.4 Antibiotic susceptibility and resistance rates of 150 Escherichia coli strains against agents

4 討論

ESBLs 現已成為介導革蘭陰性桿菌對新型廣譜β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機制，造成了臨床治療上的很大困難[5]。大腸桿菌則是產ESBLs的主代表菌株。本試驗對150 株臨床分離鹿源大腸桿菌進行ESBLs檢測采用的是CLSI 推薦的標準方法。共檢出84株為產ESBLs 菌，陽性率為56 %。由于臨床β-內酰胺酶類抗生素的大量應用及不合理使用，導致耐藥菌株廣泛傳播，尤其產ESBLs 菌引起的耐藥現象更為嚴重[6]。ESBLs由質粒介導，易在同種屬甚至不同種屬細菌間傳遞造成暴發流行，給臨床治療帶來眾多問題。ESBLs 廣泛分布于大腸桿菌中，以其水解底物譜廣、耐藥性強、易傳播等特點受到當今各國的普遍關注。產ESBLs的細菌呈世界性流行，不同地區流行的基因型不同。Livermore等[7]發現歐洲各國產ESBLs耐藥菌的類型從以TEM、SHV 型變為以CTX-M型為主。

SHV型基因主要位于克雷伯菌中，并不是我國大腸桿菌主要的ESBLs型別[8]。本研究中PCR結果顯示，150株鹿源大腸桿菌中SHV型擴增陽性率為25.33%，是東北地區主要的β-內酰胺酶型別。國內也有檢出報道，例如上海復旦大學的熊自忠等和北京醫院的胡云建等分別在2株和1株大腸桿菌中檢測到SHV-12型ESBLs。應加強對養殖場鹿感染菌株耐藥性監測，研究耐藥基因分子流行病學規律。

[1] 許桂芳，金春光.產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌耐藥性及基因同源性研究[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19(8)：1843-1844.

[2] 胡同平，張文蘭，張永梅.大腸埃希菌產超廣譜β-內酰胺酶株的基因型研究[J].中華醫院感染學雜志，2009，19(17)：2239-2241.

[3] 許穎，李曉慶，江俊等.產ESBLs大腸埃希菌耐藥基因分型研究[J].四川醫學，2009，30(9)：1363-1365.

[4] Van T T H，Chin J，Chapman T，et al.Safety of raw meat and shellfish in Vietnam：an analysis ofEscherichiacoliisolations for antibiotic resistance and virulence genes[J].International Journal of Food Microbiology，2008，124(3)：217-223.

[5] Yan J J，Ko W C，Tsai S H，et al.Dissemination of CTX-M-3and CMY-2β-lactamases among clinical isolates ofEscherichiacoliin southern Taiwan[J].Journal of Clinical Microbiology，2000，38(12)：4320-4325.

[6] Rupp M E，Fey P D.Extended spectrum beat-lactamase(ESBL)producing enterobacteriaceae considerations for diagnosis，prevention and drug treatment[J].Drugs，2003，64(4)：353-365.

[7] Livermore D M，Canton R，Gniadkowski M，et al.CTX-M：changing the face of ESBLs in Europe[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2007，59(2)：165-174.

[8] Zong Z，Lü X，Valenzuela J K，et al.An outbreak of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiproducing OXA-23 carbapenemase in western China[J].International Journal of Antimicrobial Agents，2008，31(1)：50-54.

ESBLs；

Detection of Extended-Spectrum β-Lactamases Genotypeand Antibiotic Resistance Analysis Among Escherichia coli Isolates from Sika Deer in Northeast China

Feng Tao Wang Xiaofei Liu Weishi Xue Yuan*

To detect genotypes of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)in pathogenic enterobacteria cases and guide the use of veterinary drugs，we amplified ESBL genotypes by polymerase chain reaction(PCR)and sequenced and analyzed them.Eighty-four ESBL-positiveEscherichiacolistrains were isolated from sika deer and analyzed for antibiotic resistance.Four different genotypes were detected among these ESBL positive isolates by PCR.The positive rates of TEM，CTX-M，SHV and OXA were 23.33%，3.33%，25.33%，and 8%，respectively.The results showed that the multi-resistance rate among ESBL-positive strains was higher than that of the ESBL-negative strains.

稿件運行過程

2016-04-25

修回日期：2016-05-31

發表日期：2016-11-10

大腸桿菌；

TEM 基因；

SHV基因；

CTX-M基因；

OXA基因

Escherichiacoli；

TEM gene；

SHV gene；

CTX-M gene；

OXA gene

Q959 R446.5

A

2310-1490(2016)04-321-04

采用K-B法檢測150株黑龍江、吉林、遼寧的鹿源大腸桿菌對20種抗菌藥物的耐藥性，了解耐藥表型和基因型研究超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的流行情況，以指導臨床合理用藥。結果表明：以鹿源大腸桿菌的ESBLs耐藥質粒為模板均擴增出了與預期片段大小相符的TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型基因。84株大腸桿菌為產ESBLs株，占56%。PCR擴增表明TEM、CTX-M、SHV、OXA陽性率分別為23.33%、3.33%、25.33%、8%。有9株同時檢測出TEM和SHV基因(占6%)。藥敏試驗結果顯示產ESBLs大腸桿菌對藥物的耐藥性明顯比非產酶大腸桿菌嚴重。

國家自然科學基金(31502119)；黑龍江省博士后科研啟動金(LBH-Q14002)；中央高校基本科研業務費(2572015CA21)

馮濤，女，20歲，本科生；主要從事動物藥理學研究。

*通訊作者：薛原，E-mail：xueyuan-1978@163.com