關于納米硅佐劑對新城疫抗原HI效價影響的研究

余佳璠

（惠州市惠城區動物衛生監督所，廣東惠州 516001）

關于納米硅佐劑對新城疫抗原HI效價影響的研究

余佳璠

（惠州市惠城區動物衛生監督所，廣東惠州 516001）

以硅溶膠為佐劑制備了納米硅佐劑新城疫疫苗。并考察了其與普通新城疫凍干苗，新城疫商品油苗的新城疫抗原HI效價的比較。結果表明它的效價比普通凍干苗的效價更高，持續的時間更長。與油苗相比它的黏度更低，制作成本也更廉價。本工作為納米硅作為疫苗佐劑提供了基礎數據。

新城疫；納米硅佐劑疫苗；普通凍干苗；商品油苗；抗體效價

新城疫是多種家禽共患的重大動物疫病，分布廣泛，傳播快，對養禽業的危害十分嚴重［1］。我國目前使用的疫苗主要是滅活油佐劑疫苗和凍干苗（弱毒苗），為有效控制新城疫的流行發揮了重要的作用。但是和其它獸用油乳劑疫苗一樣，油佐劑疫苗產生抗體速度較慢，而且由于其黏度過高，注射不方便，機體吸收也比較慢，只能在7日齡后使用，且成本高；而弱毒苗的安全性能差，有潛在散毒風險。因此尋找一種注射方便，穩定性好且能長久儲存的新型疫苗，用于新城疫的緊急預防接種具有重要的現實意義。

納米粒子一般是指粒徑在1～100 nm范圍內的超微粒［2，3］。納米技術是指在1～100nm的量度范圍內研究原子、分子的結構及相互作用并加以應用的技術［4］。納米粒子具有比表面積大、表面活性中心多、反應活性高、吸附和催化能力強的特點，因此會產生體積效應、表面效應、量子尺寸效應、宏觀量子隧道效應［5］。Kreuter等于1981年首次將納米材料應用于疫苗佐劑［6］。納米材料用作疫苗佐劑，使抗原結構更穩定［7］。納米材料用作疫苗佐劑，已受到極大重視［8-11］。納米佐劑是一類新型佐劑，必將成為一種理想的替代常規佐劑的新型佐劑［12］。

目前用于實踐的主要納米佐劑為納米鋁佐劑。它的主要優點在于它的有效性和安全性，且納米粒子均勻性好［13］。

最近幾年來，納米二氧化硅因其在藥物載體方面的應用受到了廣泛關注。它的優點主要體現在：①納米二氧化硅材料無毒，具有較好的生物相容性；②制備簡單，價格低廉；③載藥納米二氧化硅具有緩慢釋放藥物的特點，可以作為緩釋藥物。

硅溶膠是納米二氧化硅在水中的穩定分散體系，具有良好的分散穩定性好。因此本文選擇納米硅溶膠作為佐劑制備了新城疫疫苗。該疫苗呈半透明狀，黏度低，并可以長期保存，不易發生沉淀現象。并考察了其與凍干苗和油苗產生抗體效價的比較，比較它們在同樣的條件下對動物機體產生免疫力的效果。分別比較它們在單一免疫時和聯合免疫后產生的抗體效價，判斷納米硅佐劑疫苗是否存在它的優勢，為納米硅作為疫苗佐劑提供一些基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗設備

96孔V型反應板，25μl的微量移液器，微量振蕩器，恒溫培養箱，離心機。

1.2 納米硅佐劑疫苗樣1、樣2

樣1用20nm的納米硅佐劑和樣2中所用佐劑為15nm的納米硅佐劑。實驗中保證每一頭份所含抗原量相等。

1.3 新城疫凍干苗

新城疫凍干苗（20120617，青島易邦）由惠城區動物疫病預防控制中心提供。新城疫油苗（20120617）由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.4 試驗用雞

購自金種種雞場1日齡spf雞苗240只，試驗時間2012年8月2號至2012年10月2號

1.5 試驗用雞的處理情況

試驗用雞分別分為七組每組60只。第一組為空白對照組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射生理鹽水0.5 ml/只；第二組為基礎免疫組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只；第三組為納米硅佐劑疫苗樣1組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射樣1溶液0.5 ml/只；第四組為納米硅佐劑疫苗樣2組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射樣2溶液0.75 ml/只；第五組為基礎免疫與樣1的聯合免疫組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時再每只在頸背部皮膚注射樣1溶液0.5 ml/只；第六組為基礎免疫與樣2的聯合免疫組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時再每只在頸背部皮膚注射樣2溶液0.75 ml/只；第七組為基礎免疫與油苗的聯合免疫組，3日齡時每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時再每只在頸背部皮膚注射新城疫油苗0.5 ml/只。在7日齡時從前四組每組中抽取5只雞進行采血，分離血清，用血凝抑制（HI）實驗測其抗體水平，取平均值記錄即為其抗體效價。以后每隔4天從每組中抽取5只雞進行采血（測一個半月時間），分離血清，用血凝抑制（HI）實驗測其抗體水平，取平均值記錄即其抗體效價。在對試驗動物注射疫苗后的兩天內，應觀察試驗動物是否有應激或過敏反應，是否正常采食，并稱重觀察其是否正常生長。稱重時每天在同一時間從每組取三只試驗動物進行稱重，取平均值記錄。

1.6 4 個血凝單位病毒的制備

采用微量血凝試驗測出病毒液的血凝價，再算出 4 個血凝單位病毒的稀釋倍數。

操作方法：用定量稀釋器于V 型微量凝集板的每孔中加入PBS液 25μL，共加 4 排孔。用稀釋器分別取病毒液 25 μL至第一排和第三排的第一孔，混勻后，依次作倍比稀釋至第二排和第四排的第四孔，最后棄去 25μL，第五孔作對照用。用稀釋器吸取1% 雞紅細胞懸浮液依次加入各孔，每孔25μL. 振蕩搖勻后，靜置溫箱（37℃）內反應15 min 后，以出現完全凝集的病毒最大稀釋度為該病毒液的血凝價。3 次重復，取其平均值即為其血凝效價。若血凝價為n，則下次測抗體時該抗原所需稀釋的倍數為2的n次方除以4。

1.7 1 %紅細胞懸液的制備

采取健康青年公雞的血液加于盛有抗凝劑的離心管內，用 20倍量的 PBS 液洗滌血球，反復洗滌 3～4次，每次以2000 rpm 離心 5 min后棄去上清液，最后一次離心 10 min。吸取壓積紅血球用PBS 液配制成1 %的紅細胞懸液。

1.8 血凝抑制（H I）試驗

采用常規 B2微量法，在 96 孔V 型微量凝集板上進行，用定量稀釋器加樣和稀釋。先用稀釋器取PBS液 25 μL加入每排各孔，第十二孔加50 μL，再取待檢血清 25 μL加入第一列孔，依次作倍比稀釋至第十列孔，最后棄去25 μL。然后取4單位病毒液加入每排各孔25 μL至第十一孔（第十二列孔不加），第十一列孔為 4 單位病毒液對照（陰性對照孔）。第十二列孔為PBS液對照（陽性對照孔）。振蕩搖勻，置 37℃溫箱中反應15 min。再取1% 雞紅細胞懸浮液 25 μL 于各孔中，振蕩搖勻后，置 37℃溫箱中反應 15～20 min 后觀察判定結果。

判定標準：在對照管出現正確結果時，陰性對照孔為凝集現象，陽性對照孔為沉淀現象。則能使 4 單位病毒液凝集紅細胞作用完全受到抑制的血清最高稀釋倍數作為該血清的血凝抑制價，即抗體效價。

1.9 納米硅佐劑疫苗和油佐劑疫苗黏度對比實驗

在同樣的條件下，分別比較在1 ml的滴管內滴完1 ml納米硅佐劑疫苗樣1，1 ml納米硅佐劑疫苗樣2，以及1 ml油苗所需要的時間。分別測三次取平均值記錄。

2 結果與討論

2.1 硅溶膠的電子顯微鏡照片

圖1 硅溶膠的電子顯微鏡照片

圖1硅溶膠的投射電子顯微鏡照片（本實驗室電子顯微鏡拍攝）。從該圖可以看出，硅溶膠顆粒為類球形，尺寸在15～20 nm之間，單分散性好，且無團聚現象。

2.2 納米硅佐劑疫苗和油苗的黏度比

表1 納米硅佐劑疫苗樣1、納米硅佐劑疫苗樣2和油苗的黏度比

黏度值即1ml溶液滴完所需要的時間，時間越短，說明黏度越低，時間越長，黏度越高。由表1可以看出油苗的黏度要比納米硅佐劑的黏度高，樣2又比樣1的黏度高，而黏度過高會影響到疫苗的注射和吸收，因此在黏度上納米硅佐劑更有優勢。而且免疫油苗的試驗動物每頭份成本要7分錢，而納米硅佐劑的成本只需0.2分錢。說明納米硅佐劑的成本更低。

表3 納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的 HI效價對比

2.3 納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的HI效價對比

表3為納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的HI效價對比。在7日齡初次測得的實驗結果表明基礎免疫的效價為6log2，納米硅佐劑疫苗樣1的效價也為6log2，而納米硅佐劑疫苗樣2在此時就達到了效價為8 log2。說明佐劑疫苗比例不同會產生不同的效價，因此可以調整納米硅佐劑疫苗的濃度比例，使動物機體在短時間內迅速產生較高的抗體效價，從而具有更好的免疫保護力。在23日齡時，基礎免疫組的效價為5 log2，納米硅佐劑疫苗樣1的效價為6.5 log2，納米硅佐劑疫苗樣2的效價為7 log2。說明在此時納米硅佐劑疫苗比凍干苗產生的抗體水平高。在43日齡時，基礎免疫組的效價為5log2，而納米硅佐劑疫苗的效價都為6 log2，比基礎免疫組高出1個單位的效價，充分說明在同樣的情況下納米硅佐劑疫苗能產生更高抗體的效價，這也說明了納米硅佐劑具有緩釋作用，能使抗原逐漸的釋放，使動物機體在較長的時間內保持有效的抗體效價。在進行聯合免疫后，這主要體現在23日齡后，動物機體產生的抗體效價更高，說明納米硅佐劑疫苗與凍干苗起到了很好的協同作用。

雖然與油苗相比沒有油苗的效價高，但從表1可以知道納米硅佐劑黏度更低，成本也更低，所以還是具有一定的優勢。

3 結論

由上述實驗結果可知，納米硅佐劑疫苗的主要優點為：

（1）吸收快，能使動物機體在短時間內產生有效的抗體效價。

（2）具有非常好的緩釋效果，能使動物機體在長時間內保持有效的抗體效價。

因此，納米硅佐劑疫苗可以作為一種新型疫苗來開發利用。

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