消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl—2、survivin與化療藥敏性的關(guān)系研究

陳希++趙建華

[摘要] 目的 研究消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的關(guān)系。 方法 選擇62例消化道惡性腫瘤患者的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的腫瘤組織，進(jìn)行四氮唑鹽（MTT）法原代細(xì)胞培養(yǎng)體外化療藥敏性實(shí)驗(yàn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑（DDP）、長(zhǎng)春新堿（VCR）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶吟（MTX）4種常用化療藥物的體外化療藥敏性進(jìn)行檢測(cè)，并采用免疫組織化學(xué)法（SP）對(duì)原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的P53、bcl-2、survivin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 P53與bcl-2在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶間的表達(dá)呈顯著相關(guān)性（P<0.05），而survivin無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。DDP、VCR、MTX對(duì)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞抑制率顯著低于原發(fā)灶（P<0.05），而PTX在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制情況無(wú)顯著差異（P>0.05）；原發(fā)灶中的化療藥物抑制率均與P53、bcl-2、survivin不相關(guān)（P>0.05）；而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，P53與DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P53、bcl-2、survivin的表達(dá)情況及化療藥敏性均體現(xiàn)出異質(zhì)性，術(shù)后化療應(yīng)盡量避免化療靶目標(biāo)的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

[關(guān)鍵詞] 消化道腫瘤；淋巴結(jié)；凋亡抑制蛋白；化療藥敏性

[中圖分類號(hào)] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）25-0012-03

Research of relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors

CHEN Xi ZHAO Jianhua

Department of Oncology， the First Peoples Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors. Methods The tumor tissue and metastasis lymph nodes of 62 patients with gastrointestinal tumors were collected， and the tumor cells chemosensitivity to DDP， VCR， PTX， MTX were detected by MTT assay，meanwhile the expression of P53， bcl-2 and survivin in primary tumors and lymph node metastases were detected by immunohistochemically. Results The expression of P53 and bcl-2 in primary tumors and lymph node metastases were significant correlation（P<0.05），while survivin were not（P>0.05）. The inhibition of tumor cells of DDP， VCR， MTX in lymph node metastases were significantly lower than those in primary tumors（P<0.05）， while PTX were not（P>0.05）. There were no correlation between expression of P53， bcl-2， survivin and inhibition rate of tumor cells（P>0.05）， but in lymph node metastases，the expression of P53 was negative correlation with inhibition rate of tumor cells for DDP inhibition（P<0.05）， and both of survivin and bcl-2 were negative correlation for PTX（P<0.05）. Conclusion The expression of P53， bcl-2， and survivin chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors are different from primary tumors， so it is necessary to avoid the deviation of chemotherapy target postoperative as far as possible to improve the comprehensive curative effect.

[Key words] Gastrointestinal tumors； Lymph node； Apoptosis inhibiting protein； Chemosensitivity

消化系統(tǒng)惡性腫瘤在我國(guó)各類系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中占首位，其中胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌的死亡總數(shù)占前10位，在惡性腫瘤中的比例占到40.75%[1]。術(shù)后輔助化療是治療消化道惡性腫瘤的重要手段。研究表明，多數(shù)化療藥物抗腫瘤的機(jī)制都是通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)基因或腫瘤細(xì)胞DNA發(fā)揮作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[2，3]。然而化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡卻會(huì)受凋亡抑制蛋白的抑制作用，產(chǎn)生多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）表型，從而嚴(yán)重影響化療的效果。P53是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)基因，bcl-2與survivin是兩種新發(fā)現(xiàn)的耐藥基因蛋白。本研究對(duì)消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的相關(guān)性進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1月～2016年5月的62例消化道惡性腫瘤并伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，疾病診斷均經(jīng)手術(shù)及病理證實(shí)，排除術(shù)前放、化療者。其中男35例，女27例；年齡29～78歲，平均（59.44±4.16）歲；胃癌28例，食管癌17例，大腸癌17例。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求，且取得所有患者的知情同意。

1.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及化療藥敏性實(shí)驗(yàn)

采集患者的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的腫瘤組織置于雙抗培養(yǎng)液中，在2 h內(nèi)進(jìn)行四氮唑鹽（MTT）法原代細(xì)胞培養(yǎng)體外化療藥敏性實(shí)驗(yàn)。選用4種常用化療藥物：順鉑（DDP）、長(zhǎng)春新堿（VCR）、甲氨蝶吟（MTX）、紫杉醇（PTX），藥物終濃度以血漿峰值藥物濃度為準(zhǔn)，以不加藥物的細(xì)胞為對(duì)照，每種藥物均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，接種細(xì)胞懸液200 μL/孔，振蕩混勻后加入5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，溫度控制在37℃，加5 g/L噻唑藍(lán)（MTT）20 μL/孔再進(jìn)行3～24 h的培養(yǎng)。終止培養(yǎng)后進(jìn)行離心處理?xiàng)壣锨澹蠹尤攵谆鶃喌\（DMSO）100 μL/孔，混勻后使用酶標(biāo)儀570 nm對(duì)各孔吸光度（A）進(jìn)行測(cè)試。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）=（1-給藥孔A/對(duì)照組A）×100%。

1.3免疫組織化學(xué)法（SP）測(cè)定

采用SP法對(duì)原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的P53、bcl-2、survivin進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。由深圳市國(guó)賽生物技術(shù)有限公司提供鼠抗人P53、bcl-2、survivin單克隆抗體及免疫組織化學(xué)染色試劑盒。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。每張切片取5個(gè)高倍視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，P53染色陽(yáng)性表現(xiàn)為胞核著黃色，bcl-2與survivin均為胞膜和（或）胞質(zhì)著黃色。著色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)與陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)參考李勇[4]的研究，根據(jù)二者的積分乘積判斷陰陽(yáng)性，即乘積=1為（-）；乘積2～3為（+）；乘積4～7為（++）；乘積≥8為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析，等級(jí)資料采用Wilcoxon配對(duì)秩和檢驗(yàn)與Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的P53、bcl-2、survivin表達(dá)情況

P53在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)一致率為68.04%（36/62），survivin為25.81%（16/62），bcl-2為43.55%（27/62）；P53與bcl-2的表達(dá)一致率較高，而survivin較低。三者在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著差異（P>0.05）。P53與bcl-2在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間的表達(dá)呈顯著相關(guān)性（P<0.05），而survivin無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。

2.2 4種化療藥物對(duì)原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞抑制率比較

PTX對(duì)原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞抑制率無(wú)明顯差異（P>0.05），但DDP、VCR、MTX對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞抑制率顯著低于原發(fā)灶（P<0.05）。直線相關(guān)分析顯示，MTX對(duì)原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞抑制率呈正相關(guān)性。

2.3原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin表達(dá)與化療藥物抑制率的關(guān)系

原發(fā)灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，P53與DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.426，P<0.05）；survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.399，r=-0.483，P<0.05）。

3討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]，消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例達(dá)到60%～80%[6，7]。在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，亞克隆細(xì)胞群的侵襲能力、化療藥敏性等部分細(xì)胞學(xué)特性可能會(huì)發(fā)生異質(zhì)變化。腫瘤的MDR與不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)調(diào)的級(jí)聯(lián)樣網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)機(jī)制及多種基因/蛋白的表達(dá)有密切聯(lián)系[8]，其呈現(xiàn)的明顯異質(zhì)性變化涉及到腫瘤進(jìn)展過(guò)程中不同細(xì)胞亞群發(fā)生的基因及大分子改變[9]，但目前國(guó)內(nèi)尚缺乏有關(guān)消化道腫瘤轉(zhuǎn)移灶凋亡抑制蛋白的表達(dá)與化療耐藥性的關(guān)系的研究報(bào)道。

P53、bcl-2及survivin是三種具有細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)功能的凋亡抑制蛋白，也是與消化道腫瘤耐藥相關(guān)的因子之一。本研究顯示，P53與bcl-2在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)一致率較高，而survivin較低，提示消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶凋亡抑制蛋白的表達(dá)發(fā)生了異質(zhì)性變化；4種常用化療藥物對(duì)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的抑制率有明顯差異，提示轉(zhuǎn)移灶的化療藥敏性也具有異質(zhì)性。

目前認(rèn)為，MDR形成機(jī)制至少包括兩個(gè)途徑，其一為經(jīng)典耐藥途徑，其二為化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞后產(chǎn)生的凋亡抵抗[10，11]。化療藥物可對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA構(gòu)成破壞，細(xì)胞可通過(guò)P53通路反式激活P21WAF/CIP1基因程序而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與野生型P53不同，突變型P53不具有對(duì)bcl-2及survivin負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[12]；bcl-2可通過(guò)影響自擾細(xì)胞色素線粒體正常釋放而干擾蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，是最終凋亡調(diào)控點(diǎn)；而survivin可通過(guò)直接抑制caspase阻斷細(xì)胞凋亡。故化療藥物作用于靶點(diǎn)時(shí)，bcl-2與survivin這兩種抗凋亡蛋白可對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，從而出現(xiàn)MDR表型[13，14]。

相關(guān)性分析提示原發(fā)灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無(wú)明顯相關(guān)性，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中卻與不同化療藥物的抑制率呈負(fù)相關(guān)，提示轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶具有MDR異質(zhì)性，主要耐藥相關(guān)因子不同而使化療藥物的抑制率有所差異，這可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的MDR是涉及多種基因/蛋白共同參與、機(jī)制復(fù)雜的多環(huán)節(jié)網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)有關(guān)。孫延霞[15]研究指出，腫瘤組織耐藥相關(guān)因子表達(dá)與某種化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系，說(shuō)明該耐藥相關(guān)因子高表達(dá)時(shí)對(duì)某種藥物敏感性下降表現(xiàn)出相對(duì)化療耐藥。

綜上所述，消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P53、bcl-2、survivin的表達(dá)情況及化療藥敏性均體現(xiàn)出異質(zhì)性，提示術(shù)后化療應(yīng)盡量避免化療靶目標(biāo)的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

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（收稿日期：2016-06-22）