顯微技術(shù)在牛黃清心丸（局方）質(zhì)量控制中的應(yīng)用

聶黎行+張燁+張南平+胡曉茹+康帥+侯建忠+戴忠+馬雙成

[摘要]探討顯微技術(shù)在牛黃清心丸（局方）質(zhì)量控制中的應(yīng)用。對(duì)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的顯微特征進(jìn)行了總結(jié)，并新建了未規(guī)定檢驗(yàn)項(xiàng)目的山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)4味藥材的顯微鑒別方法。首次采用顯微技術(shù)檢查中成藥摻偽，建立了牛黃清心丸（局方）中山藥混偽品山薯的檢查方法。1個(gè)廠家的2批次樣品未檢出羚羊角，2個(gè)廠家的3批次抽樣檢出山薯。所建方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、直觀、經(jīng)濟(jì)，可更加全面地控制牛黃清心丸（局方）的質(zhì)量。傳統(tǒng)的顯微技術(shù)能夠在指標(biāo)成分缺乏或含量過低的中藥的鑒別方面發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]牛黃清心丸（局方）； 顯微； 鑒別； 檢查； 摻偽

[Abstract]Application of microscopic spectroscopy in quality control of Niuhuang Qingxin pills was discussed. First， microscopic characteristics specified by the statutory standard of Niuhuang Qingxin pills were summarized. Then new identification method was established for Dioscoreae Rhizoma， Saigae Tataricae Cornu， Cinnamomi Cortex and Saposhnikoviae Radix. Finally， microscopic spectroscopy was used for test of Dioscoreae Rhizoma′s adulterant Dioscoreae Fordii Rhizoma.It was the first time for this technology being applied in adulteration test of Chinese patent medicine.The results showed that Saigae Tataricae Cornu was not detected in 2 batches of Niuhuang Qingxin pills from 1 manufacturer while Dioscoreae Fordii Rhizoma was detected in 3 batches of samples from 2 manufacturers. The proposed methods were accurate， simple， rapid， objective and economic， which offered a more comprehensive approach for quality control of Niuhuang Qingxin pills. It was indicated that conventional technology such as microscopic spectroscopy could play an important role in identification of traditional Chinese medicine whose index ingredient was deficient or tiny.

[Key words]Niuhuang Qingxin pills； microscopic spectroscopy； identification； test； adulteration

doi：10.4268/cjcmm20162007

牛黃清心丸（局方）由牛黃、當(dāng)歸、川芎、甘草、山藥、黃芩、炒苦杏仁、大豆黃卷、大棗、炒白術(shù)、茯苓、桔梗、防風(fēng)、柴胡、阿膠、干姜、白芍、人參、六神曲（炒）、肉桂、麥冬、白蘞、蒲黃（炒）、人工麝香、冰片、水牛角濃縮粉、羚羊角、朱砂、雄黃等29味中藥材粉碎配研制成，具有清心化痰，鎮(zhèn)驚祛風(fēng)的功效，用于風(fēng)痰阻竅所致的頭暈?zāi)垦！⑻迪眼帐ⅰ⑸裰净靵y、言語不清及驚風(fēng)抽搐、癲癇^[1]。2014年我院承擔(dān)了該品種的國(guó)家藥品監(jiān)督抽驗(yàn)任務(wù)，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部第一增補(bǔ)本，除制劑通則外，包括【性狀】、【鑒別】、【檢查】3項(xiàng)。其中顯微鑒別項(xiàng)涉及14個(gè)藥味，包括茯苓、白芍、炒白術(shù)、麥冬、甘草、黃芩、桔梗、炒苦杏仁、大棗、大豆黃卷、蒲黃（炒）、朱砂、雄黃、水牛角濃縮粉等原料藥材；薄層鑒別4項(xiàng)，包括牛黃、黃芩、人參、當(dāng)歸的鑒別。另有豬去氧膽酸的【檢查】項(xiàng)，防止人工牛黃冒充牛黃投料。牛黃清心丸（局方）處方藥味眾多，且輔料煉蜜干擾嚴(yán)重，顯微鑒別難度較大，尚無相關(guān)資料或文獻(xiàn)可供參考，故對(duì)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的顯微特征進(jìn)行了研究和總結(jié)。為更全面地控制本品質(zhì)量，研究并新建了執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定檢驗(yàn)項(xiàng)目的山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)四味藥材的顯微鑒別方法。此外，針對(duì)檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的個(gè)別樣品使用山藥混偽品投料的現(xiàn)象，首次采用顯微技術(shù)建立了中成藥中摻偽檢查的新方法。所建方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、直觀、經(jīng)濟(jì)，可為大處方原粉制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

奧林巴斯BX50-32H01生物顯微鏡。分析純水合氯醛購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。9個(gè)廠家生產(chǎn)的牛黃清心丸（局方）38批次，均為2014年國(guó)家藥品監(jiān)督抽驗(yàn)樣品。山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)對(duì)照藥材來自中國(guó)食品藥品檢定研究院。牛黃、當(dāng)歸、川芎、甘草、山藥、黃芩、炒苦杏仁、大豆黃卷、大棗、炒白術(shù)、茯苓、桔梗、防風(fēng)、柴胡、阿膠、干姜、白芍、人參、六神曲（炒）、肉桂、麥冬、白蘞、蒲黃（炒）、人工麝香、冰片、水牛角濃縮粉、羚羊角、朱砂、雄黃、煉蜜等原輔料由天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠提供。山藥偽品山薯由酒泉市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心收集，經(jīng)侯建忠主任藥師鑒定為薯蕷科植物山薯Dioscorea fordii Prain et Burkill.的干燥根莖。

取牛黃清心丸（局方），按執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。另取質(zhì)量較好的天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠生產(chǎn)的樣品3批，山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)對(duì)照藥材，水合氯醛液加熱透化后，置顯微鏡下觀察。通過與對(duì)照藥材對(duì)比，并結(jié)合文獻(xiàn)分析^[2-5]，新建牛黃清心丸（局方）中山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)的顯微鑒別方法。再取問題樣品、山薯、分別以山藥對(duì)照藥材和山薯投料的模擬制劑，透化后置顯微鏡下觀察，經(jīng)比較和驗(yàn)證，新建牛黃清心丸（局方）中山薯混偽投料的顯微檢查方法。38批次抽樣均按標(biāo)準(zhǔn)方法和新建的鑒別和檢查方法測(cè)定、觀察，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的顯微鑒別特征 不規(guī)則分枝狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛試液溶化；菌絲無色或淡棕色，直徑4～6 μm（茯苓）。草酸鈣簇晶直徑18～32 μm，存在于薄壁細(xì)胞中，常排列成行，或1個(gè)細(xì)胞中含有數(shù)個(gè)簇晶（白芍）。草酸鈣針晶細(xì)小，長(zhǎng)10～32 μm，不規(guī)則地充塞于薄壁細(xì)胞中（炒白術(shù)）。草酸鈣針晶束長(zhǎng)24～50 μm，存在于類圓形或橢圓形黏液細(xì)胞中（麥冬）。纖維束周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維（甘草）。韌皮纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細(xì)（黃芩）。聯(lián)結(jié)乳管直徑14～25 μm，含淡黃色顆粒狀物（桔梗）。石細(xì)胞橙黃色，貝殼狀，壁較厚，較寬一邊紋孔明顯（炒苦杏仁）。果皮表皮細(xì)胞黃棕色至紅棕色，表面觀多角形，斷面觀角質(zhì)層厚約10 μm（大棗）。種皮柵狀細(xì)胞淡黃色，長(zhǎng)45～80 μm（大豆黃卷）。花粉粒黃色，類圓形或橢圓形，直徑約30 μm，外壁有微細(xì)疣狀突起（蒲黃）。不規(guī)則細(xì)小顆粒暗棕紅色，有光澤，邊緣暗黑色（朱砂）。不規(guī)則碎塊金黃色或橙黃色，有光澤（雄黃）。不規(guī)則碎塊灰白色或淺灰黃色，稍具光澤，表面有灰棕色色素顆粒，并有不規(guī)則縱長(zhǎng)裂縫（水牛角濃縮粉）。結(jié)果38批次樣品均符合規(guī)定，14味藥材的顯微鑒別特征見圖1。

2.2 山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)的顯微鑒別 牛黃清心丸（局方）中山藥、羚羊角、肉桂、防風(fēng)的顯微鑒別特征：草酸鈣針晶束存在于黏液細(xì)胞中，長(zhǎng)約至240 μm，針晶粗2～5 μm。淀粉粒三角狀卵形或矩圓形，直徑24～40 μm，臍點(diǎn)短縫狀或人字狀（山藥）。不規(guī)則透明碎塊稍有光澤，均勻分布裂縫狀或長(zhǎng)圓形空隙（羚羊角）。石細(xì)胞類方形或類圓形，直徑32～88 μm，壁一面菲薄。纖維大多單個(gè)散在，長(zhǎng)梭形，長(zhǎng)195～920 μm，直徑約至50 μm，壁厚，木化，紋孔不明顯（肉桂）。油管含金黃色分泌物，直徑約30 μm（防風(fēng)）。上述顯微鑒別特征見圖2。按擬定的鑒別方法考察了9個(gè)企業(yè)的38批次抽樣，結(jié)果均檢出山藥、肉桂和防風(fēng)，1個(gè)廠家的2批次抽樣未檢出羚羊角，不排除未投料的可能性。

2.3 山藥混偽品山薯的檢查 在檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別樣品檢出不屬于處方藥味的異常石細(xì)胞，見圖3。文獻(xiàn)報(bào)道山藥的混淆品及偽品較多，除地方標(biāo)準(zhǔn)收載的褐苞薯蕷、參薯、日本薯蕷、山薯外，還有用木薯、番薯等冒充山藥使用，其中褐苞薯蕷、山薯、木薯、參薯均含石細(xì)胞^[6-8]。經(jīng)與文獻(xiàn)比較^[9-10]，認(rèn)為為驗(yàn)證上述結(jié)論，收集來源明確的山薯，粉碎成細(xì)粉，觀察其顯微特征。同時(shí)按牛黃清心丸（局方）處方比例，分別以山藥對(duì)照藥材和山薯細(xì)粉投料，加入其他原料和輔料煉蜜，制成模擬制劑，置顯微鏡下觀察。結(jié)果以山藥投料的模擬制劑未檢出異常石細(xì)胞，山薯和以山薯代替山藥投料的模擬制劑均檢出與文獻(xiàn)描述基本一致的石細(xì)胞。說明采用顯微技術(shù)檢查牛黃清心丸（局方）中山薯摻偽投料，方法可行。擬定方法要求不得檢出山薯石細(xì)胞（類方形、類多角形、類圓形，直徑10～50 μm，紋孔、孔溝細(xì)密而明顯，內(nèi)含草酸鈣方晶）。按上述方法對(duì)38批次的牛黃清心丸（局方）抽樣進(jìn)行檢查，結(jié)果2個(gè)廠家的3批抽樣檢出山薯石細(xì)胞。2.2項(xiàng)下鑒別結(jié)果表明，所有樣品均檢出山藥顯微特征，故推測(cè)這3批樣品并非純粹以山薯替代山藥投料，而是山薯混偽山藥投料。山薯、以山薯代替山藥投料的模擬樣品及問題樣品中觀察到的石細(xì)胞見圖3。

3 討論

牛黃清心丸（局方）是由29味原料藥材制成的原粉制劑，處方藥味眾多，化學(xué)成分復(fù)雜，指標(biāo)成分含量偏低，且不乏山藥、羚羊角這類指標(biāo)成分尚未明確的藥味。在此情況下，傳統(tǒng)的顯微技術(shù)反而能夠在鑒別方面發(fā)揮很好的作用，與化學(xué)方法互為補(bǔ)充。本文總結(jié)了牛黃清心丸（局方）執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的14味藥材的顯微鑒別特征，為相關(guān)檢驗(yàn)工作提供了參考。進(jìn)一步新建了4味藥材的顯微鑒別項(xiàng)目，填補(bǔ)了質(zhì)量控制項(xiàng)目的缺失，為標(biāo)準(zhǔn)增修訂提供了科學(xué)依據(jù)。近年來采用薄層色譜、高效液相色譜、液質(zhì)聯(lián)用法檢查中藥摻偽的研究較多，但采用顯微技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本文創(chuàng)新性地采用顯微技術(shù)建立了牛黃清心丸（局方）中山薯混偽山藥投料的檢查方法，為中藥摻偽檢查提供了新的思路。

化學(xué)分析的飛速發(fā)展使其成為中藥質(zhì)量控制的最主要手段，經(jīng)典的顯微鑒別方法往往未受到足夠重視，事實(shí)上后者在中藥材和原粉投料中成藥的真?zhèn)舞b別方面仍舊發(fā)揮著獨(dú)特而不可或缺的作用。隨著顯微透射、顯微定量、超高分辨率顯微、激光顯微切割等分析方法的發(fā)展和應(yīng)用，這一技術(shù)必將煥發(fā)新的活力。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]