運動對非酒精性脂肪肝形成中內質網應激PERK/eIF2a、IRE1/XBP1通路的影響

李軍漢 李恩 張仲陽 蘇全生

摘 要：觀察內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路在非酒精性脂肪肝（NAFLD）中的變化，探討運動對非酒精性脂肪肝（NAFLD）的預防作用及作用機理。方法：SD雄性大鼠隨機分為對照組、模型組和運動組3 組，每組10只。對照組給予普通飼料喂養，模型組予高脂飼料喂養，運動組在高脂飼料喂養的同時予運動干預，連續8周，直至實驗結束。油紅O染色觀察肝臟病理形態變化，western blot檢測PERK、 eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達。結果：1）與對照組比較，模型組油紅O脂滴數量增加，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達增加；2）與模型組比較，運動組油紅O脂滴數量減少，PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達降低。結論：8周高脂飲食可成功復制NAFLD動物模型，內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路參與NAFLD的形成。運動對NAFLD形成具有較好的預防作用，其機制可能與運動可降低PERK/eIF2a和IRE1/XBP1通路蛋白表達，減少內質網應激有關。

關鍵詞： 內質網應激；非酒精性脂肪肝；運動

中圖分類號： G 804.2 文章編號：1009783X（2016）05045904 文獻標志碼： A

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化和脂肪性肝硬化4個病理過程[1]。近年來，NAFLD 發病率呈上升趨勢，嚴重危害人民健康，但其發生機制仍不清楚[2]。研究[34]報道，ERS在心血管、神經元變性和糖尿病等疾病中起著重要作用。有關ERS相關蛋白在NAFLD中的作用機制，國內外僅有少量文獻[56]報道。迄今為止，內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑在NAFLD中的作用尚未見文獻報道。本研究擬通過高脂飼料喂養誘導大鼠NAFLD動物模型，并采用運動干預，探討NAFLD形成中的內質網應激作用機制及運動對NAFLD的干預作用和作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SD雄性大鼠30只，SPF/VAF 級，體重為（195.36±5.87）g，分籠飼養，自由飲食飲水，室溫18～22 ℃，相對濕度45%～55%，12 h光照和12 h熄燈模擬晝夜交替。

1.2 分組與喂養

所有大鼠適應性喂養3 d后，隨機分為對照組、模型組和運動組，每組10只。對照組給予普通飼料喂養，模型組予高脂飼料喂養，運動組在高脂飼料喂養的同時予運動干預，連續8周，直至實驗結束。高脂飼料配方[7]如下：基礎飼料71.8%，豬油18%，膽固醇2.0%，膽鹽0.2%，蛋黃粉8%。

1.3 運動方法

運動方式參照文獻[8]報道，實驗前先進行3 d適應性游泳練習，每天1次，每次15 min，每天遞增10～20 min，經1周增加至60 min，以后各周都維持此運動量，直至實驗結束。訓練時驅趕不游泳大鼠，以防漂浮水面。正式運動期間每周運動6 d，每天1次，每次60 min。運動條件：長150 cm×寬60 cm×高70 cm的游泳池，水溫（31±1）℃，水深60 cm，超過大鼠身長的2倍。

1.4 樣本采集與處理

大鼠處死前先禁食12 h，稱重后以2%戊巴比妥鈉溶液4 mL/kg腹腔內注射麻醉，新潔爾滅消毒皮膚，以腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟，置于4 ℃生理鹽水中反復漂洗，在肝左葉中部切取1 cm×1 cm×1 cm，放置于液氮中速凍，轉入-80 ℃冰箱儲存，用于Western bolt檢測。取肝右葉一部分固定包埋，用于冰凍切片和油紅O染色。

1.5 測試指標與方法

1.5.1 油紅O染色觀察肝臟病理形態

油紅O染色方法：肝臟冰凍切片（5 μm厚度）用于脂質染色。脂滴為紅色，每張切片在200倍光鏡顯微鏡下隨機取5個視野，采用ImagePro plus 6.0圖像分析系統進行半定量分析，計算每個視野下紅色脂滴光密度，每張切片5個視野下紅色脂滴光密度相加后取平均值，用每組平均光密度表示紅色脂滴的多少，單位以AIOD.μm2表示。

1.5.2 western blot法測PERK/ eIF2a和IRE1/XBP1途徑蛋白表達

將50 mg的冰凍肝組織置于勻漿器中，用剪刀盡量將組織塊剪碎，加入500 mL組織裂解液，反復研磨使組織盡量碾碎，30 min的裂解后，以2 000 r/min，4 ℃離心組織勻漿10 min，取上清液，再以12 000 r/min，4 ℃ 離心30 min，回收上清液，取小部分上清液用BCA法測定蛋白濃度。等量蛋白樣品（50 μg）經12.5%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上。經5 %脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔單抗PERK（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗eIF2a（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗IRE1（1∶2 000，abcam公司）、兔單抗XBP1（1∶1 000，abcam公司）和兔單抗βactin（1∶1 000，abcam公司）室溫孵育1 h后，4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入相應的HRP結合的羊抗兔IgG（1∶2 000，abcam公司）室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL發光液，1 min后于暗室內進行膠片曝光、顯影、定影、晾干。βactin作為內參，并用Gelpro32圖像分析軟件進行分析，蛋白表達量用光密度比值（OD ratio）表示，蛋白表達量用“目的蛋白/βactin”計算。

1.6 數理統計方法

數據采用統計軟件SPSS 16.0進行處理，計量資料以平均值±標準差（X±S）表示，采用單因素方差分析（One way ANOVA）對多組樣本均數進行比較，M組、EM組、FM組和EFM組4組比較采用雙因素方差分析（Univariate），P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 研究結果

2.1 各組肝組織病理形態變化

油紅O染色結果（如圖1和表1）所示：對照組肝細胞未見明顯脂滴；模型組肝細胞胞漿內橘紅色脂滴數量增多，大小不一，以小泡性脂肪滴為主；運動組肝細胞胞漿內可見少量橘紅色脂滴，脂滴數量在對照組和模型組之間。

2.2 各組大鼠肝臟內質網應激PERK/eIF2a途徑蛋白表達變化

各組大鼠肝組織PERK、eIF2a蛋白表達（如圖2和表2）結果顯示：與對照組比較，模型組和運動PERK、eIF2a蛋白表達升高，其中模型組具有非常顯著性差異（P<0.01），運動組PERK蛋白表達具有非常顯著性差異（P<0.01），eIF2a蛋白表達差異不具有顯著性；與模型組比較，運動組PERK、eIF2a蛋白表達降低，差異具有非常顯著性（P<0.01）。

2.3 各組大鼠肝臟內質網應激IRE1/XBP1途徑蛋白表達變化

各組大鼠肝組織IRE1、XBP1蛋白表達（如圖2和表3）結果顯示：與對照組比較，模型組和運動組IRE1、XBP1蛋白表達升高，差異具有非常顯著性（P<0.01）；與模型組比較，運動組IRE1、XBP1蛋白表達降低，差異具有非常顯著性（P<0.01）。

3 討論與分析

3.1 動物模型的建立

為深入研究NAFLD的發病機制，建立與人類病變相似的動物模型極為重要。在現有的NAFLD動物模型中，主要有先天性“轉基因動物”“化學物質誘導”、病毒誘導及高脂飼料誘導等[9]。高脂飼料誘導的NAFLD動物模型，其病變過程較慢，方法簡單、病理特征與人類相似、成功率高而被廣泛應用，是國內外學者最常采用的造模方法[10]。

診斷NAFLD的金標準是病理組織學[9]。本實驗采用連續8周高脂飲食建立大鼠NAFLD模型，油紅O染色可見模型組肝細胞胞漿內脂滴數量增多，大小不一。與對照組比較，模型組油紅O脂滴光密度值顯著升高（P<0.05），提示本研究NAFLD動物模型復制成功。

3.2 內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑在NAFLD形成中的變化

PERK是介導ERS反應的重要分子，正常狀態下，PERK與GRP78結合成無活性的復合物；ERS時，PERK與GRP78解離，解離出的PERK寡聚化并激活，使eIF2a磷酸化，mRNA和蛋白的轉錄翻譯水平下調，ER蛋白負荷減輕[11]。林志楠等[12]報道，pPERK蛋白在胰島素抵抗大鼠肝組織中表達升高。本研究結果顯示，PERK和eIF2α在生理狀態下也少量表達，而在模型組大鼠肝組織中PERK和eIF2α表達明顯升高，提示ERS通過介導PERK/eIF2α通路參與高脂飲食誘導NAFLD的形成。

正常狀態下，IRE1與GRP78結合成無活性的復合物，ERS時，IRE1與GRP78解離，解離出的IRE1通過非常規剪接XBP1 mRNA激活XBP1。XBP1能促進陪伴蛋白和自身基因的轉錄，也能促進ERS相關其他靶基因的轉錄。它是CREB/ATF家族的一個bZIP轉錄因子。XBP1表達水平的改變會直接影響ERS的反應強度[13]。對于IRE1/XBP1信號通路，國內外的研究大多局限于體外研究。Kirkpatrick等[14]報道，與接受相同處理的XBP1+/+細胞相比，XBP1-/-小鼠的胚胎成纖維細胞在發生ERS后，后者IRS1的酪氨酸磷酸化水平顯著降低，IRS1絲氨酸磷酸化顯著增強，抑制胰島素信號轉導。而IRE1/XBP1信號通路在大鼠體內的作用未見研究報道。本研究結果顯示，高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝組織IRE1、XBP1蛋白表達較對照組明顯升高，提示ERS通過介導IRE1/XBP1通路參與高脂飲食誘導NAFLD的形成。

3.3 運動對NAFLD形成的預防作用

現有研究[15]證實，耐力運動可較好地預防脂肪肝。吳明方等[16]報道16周有氧運動可改善NAFLD患者脂質代謝紊亂，降低患者血漿SREBP1 c、TNFa水平。晉娜[17]報道運動可減輕肥胖程度，有效預防脂肪肝。分子水平研究報道，有氧運動對高脂飲食誘導的NAFLD有預防作用可能與其抑制ChREBP基因表達[18]、降低肝臟TNFa mRNA的表達和脂聯素mRNA表達有關[19]。有關運動對內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑的影響尚未見文獻報道。本研究結果顯示：與模型組比較，運動組肝細胞胞漿內脂滴數量減少，油紅O脂滴光密度值顯著降低（P<0.05），PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達降低，提示運動對NAFLD具有較好的預防作用，其機制可能與其減低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達，減少內質網應激有關。

4 結論

8周高脂飲食可成功復制NAFLD動物模型，內質網應激PERK/eIF2a和IRE1/XBP1途徑參與NAFLD形成，運動對NAFLD形成具有較好的預防作用，其機制可能與其降低PERK、eIF2a和IRE1、XBP1蛋白表達，減少內質網應激有關。

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