高效液相色譜法測定去叔丁基杯[6]芳烴的含量

楊代曉　潘秀頡　朱茂祥

[摘 要] 目的：建立測定去叔丁基杯[6]芳烴含量的高效液相色譜方法。方法：采用 Diamonsil C18色譜柱色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 um）；流動相為甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為206 nm；柱溫 40 ℃；進樣體積：20 μL。結果：去叔丁基杯[6]芳烴主峰分離良好，HPLC 測定的線性范圍為10.0 ～60.0 μg/mL（r=0.9998），該方法在儀器精密度、日內精密度、日間精密度以及重復性方面 RSD 均在 2% 以下。結論：用高效液相色譜法對去叔丁基杯[6]芳烴進行含量測定，方法簡單，結果準確可靠。

[關鍵詞] 杯芳烴；去叔丁基杯[6]芳烴；含量測定；高效液相色譜法

中圖分類號：O657 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）05-075-03

DOI：10.11876/mimt201605028

杯芳烴（calixarene）是一類新型的大環多聚體，因其結構像酒杯而得名，該化合物在1942年首次由奧地利的金克（Zinke）合成[1]。杯芳烴可以形成主-客復合物，“空腔”的大小可以根據需要進行調節，是比冠醚和環糊精應用更加廣泛、適應性更好的主體化合物[2-3]。其中以杯[4]芳烴、杯[6]芳烴和杯[8]芳烴最為常見，在堿性條件下對叔丁基苯酚與甲醛縮合成為大環的化合物，按照苯酚單元的個數命名為杯[n]芳烴。杯芳烴有多方面重要應用價值，比在生物模擬酶、電活性LB膜等方面的應用，并且在色譜、催化反應等領域應用比較廣泛[4]。從杯[6]出發合成多種杯芳烴衍生物，去叔丁基杯芳烴是合成各種杯芳烴衍生物的中間體，對這種中間體進行含量測定可以為合成產物提供質量控制方法[5-6]。本文對中間體去叔丁基杯[6]芳烴采用高效液相色譜法進行含量的測定，并對測定方法結果的精密度、重現性等進行研究。

1 儀器與試劑

Waters2695/2996 高效液相色譜儀（DAD檢測器），自動進樣器（EMPOWER數據處理系統）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；溶劑過濾器；甲醇、乙腈（禹王試劑提供的色譜純）；三氟乙酸由江蘇康泰氟化工有限公司提供。對照品（批號：20141109）由北京精華耀邦醫藥科技有限公司提供，供試品（批號20151026）由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所提供。

2 實驗與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Diamonsil C18 （250 mm × 4.6 mm，5 um）色譜柱；流動相為甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；檢測波長為 206 nm；流速 1.0 mL/min；進樣體積為 20 ?L；柱溫 40 ℃。

2.2 溶液的制備

精密稱定10 mg的供試品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻作為儲備液。精密移取儲備液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為50 ?g/mL的供試品溶液。精密稱定10 mg的對照品，同法操作，取供試品與對照品溶液各 20 ?L注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，空白溶液以及去叔丁基杯[6]芳烴色譜圖見圖 1。

去叔丁基杯[6]芳烴主峰保留時間為7.3 min，主峰與雜質能較好分離（分離度均大于1.5），理論塔板數不低于6000，該峰的純度角小于純度閾值，表明在該條件下色譜行為良好，峰為單一峰。見圖 2。

3 專屬性考察

3.1 檢測限、定量限

精密稱定對照品適量，用甲醇：乙腈=70：30溶液逐步稀釋。將檢測限定為信噪比（3：1） 時的進樣量，將信噪比為 10：1 時的進樣量作為定量限。測得檢測限為 10 ng，定量限為30 ng。

3.2 線性范圍

精密稱定10 mg的對照品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別精密移取儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為10 ?g/mL、20 ?g/mL、30 ?g/mL、40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL的溶液。濾過（0.22 um微孔濾膜），取20 ?L續濾液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。對結果進行線性回歸，x軸為進樣濃度?g/mL，y 軸為峰面積A，通過計算得到回歸方程是：y=123583.3x-794661.9，r=0.9998（n=6）。供試品實驗結果表明：在10 ?g/mL-60 ?g/mL 范圍內線性關系良好。

3.3 儀器精密度實驗

取上述線性范圍項下50 ?g/mL溶液20 ?L，連續進樣6次，注入高效液相色譜儀，峰面積RSD低于2.0%，儀器有良好的精密度。

3.4 方法精密度實驗

取上述線性范圍項下40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL溶液，相當于含量測定供試品溶液濃度的80%、100%、120%，分別于配制0h、5h、10h后進樣，考察日內精密度；分別于配制24h、48h、72h后進樣，考察日間精密度，均注入高效液相色譜儀20 ?L。供試品實驗結果表明：日內精密度的RSD低于2.0%、日間精密度的RSD低于2.0%，樣品溶液在三天內比較穩定。

3.5 重復性實驗

分別精密稱定供試品4 mg、5 mg、6 mg，各三份，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，相當于含量測定供試品溶液濃度的80%、100%、120%，均注入高效液相色譜儀20 ?L，記錄色譜圖。高、中、低濃度的樣品所測含量RSD結果均小低于2.0%，方法有良好的重復性。

3.6 樣品含量測定

精密稱定10 mg供試品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作儲備溶液。精密移取5.0 mL儲備溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為50 ?g/mL的供試品溶液。精密稱定10 mg對照品，同法操作，注入高效液相色譜儀各20 ?L 的供試品與對照品溶液，記錄色譜圖，按峰面積計算去叔丁基杯[6]芳烴含量。結果樣品含量為94.9%。

4 討論

4.1 波長的選擇

供試品溶解加甲醇：乙腈=70：30溶解，在紫外區 200nm～380nm間進行掃描，測得最大吸收波長為206 nm；溶劑干擾峰在該波長處出現的較靠前，對樣品主峰的測定沒有影響，所以最終選擇206 nm作為檢測波長。見圖3。

4.2 流動相溶劑的優化

在色譜條件中流動相作為重要的參數，直接影響到樣品的分離，去叔丁基杯[6]芳烴有“空穴”結構，且其分子結構式中沒有帶電荷以及極性強的基團性質，決定了其不溶于水溶液，而溶于有機溶劑中[7]。所以實驗通過對甲醇、乙腈、甲醇：乙腈以及加入不同比例的三氟乙酸、乙酸等多種流動相對樣品的測定進行考察分離效果，表明不加酸時主峰對稱性差且保留時間，峰型不好，最后選擇了甲醇（加入0.1%三氟乙酸）為流動相，容易洗脫，不僅出峰時間適宜，分離度以及對稱性均較好，理論塔板數高，可以改善峰型。

4.3 柱溫的考察

取“3.6”項下濃度為 50 ?g/mL 的對照品溶液 20 ?L 注入液相色譜儀，考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱溫，記錄色譜圖。實驗結果表明：不同的溫度中各物質均能較好的分離，柱效、分離度、對稱性差別不大。考慮到柱壓對柱子的影響，選用40 ℃作為色譜柱的柱溫。

5 結論

杯芳烴結構獨特，含有疏水性基團，可以與苯環連在一起構成一個疏水性的杯狀空腔，與中性有機分子形成主-客體化合物，環上還有親水性的酚羥基整齊排列在一起，可以鰲合、輸送離子型化合物，改變苯酚單元的數目、改變橋聯基等都可以改變化合物的性質，得到不同功能的杯芳烴[8]。去叔丁基杯[6]芳烴在去掉了疏水性的叔丁基后，極性變強，在反相色譜柱上更易于洗脫，研究去叔丁基杯[6]芳烴，有利于其在色譜領域的應用[9]。本實驗通過用HPLC對其定量研究，且經方法學研究結果表明，該方法簡便、準確、重現性好、專屬性強，可為去叔丁基杯[6]芳烴的質量標準提供可靠的依據。

參 考 文 獻

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