嬰幼兒配方粉中牛磺酸的前處理優(yōu)化及氨基酸分析儀分析

劉旭輝　劉螢　張姍

[摘 要] 對奶粉中牛磺酸的前處理方法、流動相比例和柱溫箱溫度對氨基酸分析儀測定奶粉中牛磺酸的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，乙醇沉淀蛋白法能夠更好地提取奶粉中牛磺酸；柱溫25℃的條件下，用75%pH4.20檸檬酸鋰緩沖液B和25%pH8.00檸檬酸鋰緩沖液C作為流動相進(jìn)行梯度洗脫提取牛磺酸，為氨基酸分析儀測定奶粉中牛磺酸較優(yōu)條件。建立的氨基酸分析儀測定方法，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%，回收率為99.6%～101.5%，準(zhǔn)確而靈敏，適合嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸的分析。

[關(guān)鍵詞] 牛磺酸；氨基酸分析儀；分離度

中圖分類號：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）05-092-03

DOI：10.11876/mimt201605034

牛磺酸（Taurine）是一種含硫的β-氨基乙磺酸[1]。作為生理營養(yǎng)的活性物質(zhì)，對人體起著十分重要的生理調(diào)節(jié)作用[2]，尤其在促進(jìn)嬰幼兒大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，增強(qiáng)心血管功能以及鈣吸收等方面作用突出[3]，是嬰幼兒食品重要的營養(yǎng)添加劑。

目前測定牛磺酸的主要方法有分光光度法[4-5]、熒光吸光光度法[6]、高效液相色譜法[7-9]、衍生化高效液相色譜法[10]、自動電位滴定法[11]、傅立葉變換紅外線光譜法[12]等，這些方法操作煩瑣，操作要求高，比如液相色譜法儀器投入大，分析時間長；柱前衍生法靈敏度高，但操作條件要求高，干擾比較大；分光光度法樣品必須通過離子交換柱純化后才能測定。現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.26-2010[13]《嬰幼兒食品和乳品中牛磺酸的測定》采用的是高效液相色譜法，其中OPA柱后衍生和單磺酰氯柱前衍生法都需要復(fù)雜的衍生步驟。

本研究建立了嬰幼兒奶粉中牛磺酸測定的氨基酸分析儀測定方法，樣品經(jīng)乙醇沉淀蛋白進(jìn)行提取，前處理簡單，快速，可用于嬰幼兒奶粉中牛磺酸的快速定性定量檢測，為保證嬰幼兒乳品安全提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

嬰幼兒配方奶粉：市售，購于北京京客隆超市。

S-433D型氨基酸分析儀：德國Sykam公司，配有帶電子制冷功能的溶液存放單元s7130，帶電子恒溫的自動進(jìn)樣器s5200，含雙波長檢測器的反應(yīng)單元s4300，內(nèi)置在線真空脫氣機(jī)的四元梯度輸液單元；s21003K15型離心機(jī)，德國Sigma公司；N-EVAP 116型氮吹儀，美國Organomation 公司；天平：感量為 0.1mg，德國Sartorius公司。

1.2 試劑和耗材

緩沖液A： pH 2.90檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液B： pH4.20檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液C： pH8.00檸檬酸鋰緩沖液；再生液D： 檸檬酸鋰緩沖液；樣品稀釋液：pH 2.20檸檬酸鋰緩沖液、茚三酮溶液均購于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。濃鹽酸、無水乙醇、磺基水楊酸固體、異丙醇、甲醇均購于北京中科三環(huán)有限公司。異丙醇和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。玻璃帶塞水解管購于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。

1.3 奶粉前處理方法

1.3.1 酸水解法 稱取一定量樣品，精確到0.0001g，（使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)）放于水解管內(nèi)。水解管加6mol/L鹽酸10mL，使奶粉全部溶解，搖勻。氮吹10～20s后，立即蓋緊瓶蓋。于110℃恒溫干燥箱內(nèi)放置水解22h，取出后漩渦振搖，冷卻后，在6000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液0.5mL，氮吹至完全干燥，加2mL樣品稀釋液復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，供儀器測定使用。

1.3.2 蛋白沉淀法 稱取樣品約1.0000g，用0.2%鹽酸溶解樣品，并定容到10mL，使奶粉全部溶解。取2mL溶解后的試樣于10mL容量瓶中，加入無水乙醇（或磺基水楊酸）定容至刻度，靜置30min，取樣液約2mL放在2mL離心管中，在10000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液1mL，氮吹至完全干燥，加1mL樣品稀釋液復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，供儀器測定使用。

1.4 氨基酸儀測定條件

色譜柱：Sykam LCA K 07/Li，150×4.6mm，LCA K

05/Li，100×4.6mm。流動相：75%緩沖液B和25%緩沖液C。流速：0.4mL/min。柱溫：25℃。進(jìn)樣量：50μL。衍生試劑：茚三酮試劑，流速0.25mL/min。沖洗柱子試劑：再生液D，流速0.4mL/min。牛磺酸最大吸收波長在570nm處。

通過改變洗脫條件和柱溫箱溫度測試牛磺酸的分離度。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

用鹽酸水解法對樣品進(jìn)行測試，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較小；已有采用鹽酸水解法提取食品中牛磺酸的報道[14]，但在本文的研究中，此方法不適用于奶粉樣品的提取。溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白，蛋白質(zhì)并不能被完全沉淀，呈絮狀；溶解后的樣品加入乙醇沉淀蛋白后，取出再加入磺基水楊酸進(jìn)一步沉淀蛋白（乙醇和磺基水楊酸沉淀蛋白法），牛磺酸峰與雜質(zhì)峰不能很好分離；溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白后，取出再加入乙醇進(jìn)一步沉淀蛋白（磺基水楊酸和乙醇沉淀蛋白法），使得牛磺酸峰與雜質(zhì)峰分離度有所提高；而用乙醇沉淀蛋白法提取牛磺酸，分離度可達(dá)1.24，能夠完全滿足定量分析的需要。對樣品進(jìn)行回收測試，各前處理方法的回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)。表1為不同前處理方法對測定結(jié)果的影響，圖1為不同前處理方法測定牛磺酸色譜圖。

不同的前處理方法對回收率沒有太大影響。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在酸性環(huán)境中帶正電荷，而磺基水楊酸根帶負(fù)電，可與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀，磺基水楊酸正好使液體呈酸性，促使二者結(jié)合，但磺基水楊酸沉淀效果不理想，多用于沉淀微量蛋白；而乙醇沉淀蛋白法，則是利用乙醇有機(jī)相能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，導(dǎo)致蛋白變性而沉淀，效果比較理想。

2.2 流動相比例的選擇

通過改變洗脫條件進(jìn)行比較，選用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度小于1；選用100%緩沖液B進(jìn)行洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度最高達(dá)到1.07；選用80%緩沖液B和20%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度最高達(dá)到1.17，分離均不理想；選用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度最高可達(dá)到1.24，分離度達(dá)到理想值。對樣品進(jìn)行回收測試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同流動相洗脫比例對回收率沒有影響。

緩沖液A液pH為2.90，緩沖液B液pH為4.20，緩沖液C液pH為8.00，由此可得出，用pH比A液偏中性的75%緩沖液B和偏堿性25%緩沖液C一起洗脫，牛磺酸峰與雜質(zhì)峰分離度達(dá)到最好。前處理過程中，氮吹至干后，復(fù)溶液選用中性的水比選用酸性的樣品稀釋液作為復(fù)溶液更好。表2為不同流動相對測定結(jié)果的影響，圖2為不同流動相洗脫后色譜圖。

2.3 柱溫箱溫度的選擇

柱溫箱溫度調(diào)節(jié)為37℃時，用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較小；溫度調(diào)節(jié)為60℃時，用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，牛磺酸與雜質(zhì)峰不分離；溫度為37℃時，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度不理想；而柱溫箱溫度為25℃時，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，分離度可達(dá)1.24；對樣品進(jìn)行回收測試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同柱溫對樣品進(jìn)行測定對回收率沒有影響。

通過改變柱溫箱溫度，得出溫度變化對牛磺酸出峰時間影響不大，而對于雜質(zhì)峰，溫度低出峰時間前移，可與牛磺酸峰分離，實驗得出溫度在25℃時分離效果最好。表3為柱溫箱柱溫改變對分離度的影響，圖3為柱溫改變后的色譜圖。

2.4 線性范圍與檢出線

精確吸取牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.5mL分別加入到10mL容量瓶中，用水定容，進(jìn)行分析。以響應(yīng)（峰面積）為Y，濃度為X，繪制線形圖。線形方程： Y=287572.52339×X+104.14317。相關(guān)系數(shù)R2=0.9999910。

2.5 精密度

儀器精密度：配置牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10mg/L，重復(fù)測定，計算峰面積的RSD（n=6）為0.39%。

實驗方法精密度：取一定量奶粉樣品，按乙醇沉淀蛋白法測試牛磺酸含量，重復(fù)測定，其測定結(jié)果的RSD（n=6）為0.50%。

2.6 加標(biāo)回收率

取奶粉樣品按照乙醇沉淀蛋白法進(jìn)行牛磺酸含量的測試，再在樣品中加入牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，測試其回收率，回收率為99.6%～101.5%。

3 結(jié)論與討論

牛磺酸可與茚三酮試劑反應(yīng)，利用氨基酸自動分析儀檢測出其含量。通過改變前處理過程、改變儀器洗脫條件和柱溫箱的溫度，得出儀器洗脫梯度用比緩沖液A液偏中性的75%緩沖液B+25%緩沖液C作為流動相進(jìn)行洗脫，溫度在25℃時，牛磺酸的分離提取最好。

本文建立的乙醇沉淀蛋白用氨基酸分析儀檢測方法，適用于嬰幼兒配方粉中牛磺酸的定性定量檢測。結(jié)果表明本方法前處理簡單、分析速度快、準(zhǔn)確度和靈敏度較高，可作為嬰幼兒配方粉監(jiān)測手段，為保證我國嬰幼兒乳制品的安全提供技術(shù)保障。

參 考 文 獻(xiàn)

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