利用特異性SNP位點鑒定花生雜交F₁代真假雜種

韓燕　馬登超　劉譯陽　崔鳳　孫秀芹　李榮沖　萬書波　李國衛

摘要：以魯花14、Tifrunner和四粒紅為親本通過正、反交獲得的雜種F₁代群體為材料，結合親本間特異性單核苷酸多態性（single Nucleotide Polymorphism，SNP）位點，建立起一套利用限制性內切酶酶切方法鑒定花生雜交F₁，代真假雜種的技術。結果表明，真雜種表現出父、母本帶型，而假雜種只表現出母本帶型；4個組合中F₁代真雜種率為10.5%～36.7%。因此，該技術能夠有效應用于花生雜交F₁代的真假雜種鑒定。

關鍵詞：花生；SNP；雜種鑒定；限制性內切酶

中圖分類號：S565.2+Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0014-04

花生（Arachis hypogaea L.）也稱作長生果，是我國重要的農作物之一，具有較高的經濟和營養價值。通過雜交育種將優良基因導入栽培花生是花生栽培種改良的主要手段。但是，目前有關花生真假雜種鑒別的途徑較為繁瑣，形態表型觀察仍是花生雜種真偽鑒別的主要方法。然而由于花生品種間遺傳基礎狹窄，形態表型差異較小，通過形態表型鑒別真假雜種難度較大，并且有較多的假陽性。在基因組序列未知的條件下，利用人們已開發出的多種分子標記如SSR、Ah-MITE1等，對雜種后代進行鑒定，得到了廣泛地應用。

單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polynor-phisms，SNP）是指由于單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態性，包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等。SNP在基因組位點上呈現為單個核苷酸的變化，多發生在T和C之間。SNP在技術上有著較大的比較優勢，它能夠穩定地存在于生物體的整個基因組中，突變率低，在遺傳上常呈現惰性和顯性；此外，SNP能夠分辨等位基因上的差異，簡單地對基因進行分型，從而擺脫了電泳分型的瓶頸。在此基礎上，SNP成為繼RFLP和SSR后發展起來的第三代遺傳標記，被廣泛運用在動植物性狀的關聯性研究中。在花生中，Zhou等利用簡化基因組測序技術發現的SNP位點，構建了花生基于高密度SNP的遺傳圖譜。Chopra等利用下一代轉錄組測序技術鑒定了市場上四類花生品種的SNP，結果顯示SNP可被有效用為分子標記來鑒定花生品種資源。

本研究旨在建立一套利用不同花生品種問存在的SNP位點，根據其多態性選取合適的酶切位點，設計開發有效引物，擴增片段，利用上述酶切位點進行酶切驗證，根據其片段的多態性來簡便、有效地鑒定花生F₁代真假雜種的鑒定技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以早熟直立大花生品種魯花14、匍匐型品種Tifrunner與四粒紅品種及以其作為親本正反交得到的F₁代群體為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取花生基因組DNA。取新鮮幼嫩的葉片約0.5g，用液氮研磨成粉狀；加入0.5mL65℃預熱的CTAB抽提緩沖液（使用前加入2%β-巰基乙醇），充分混合，65℃水浴30min，期間搖動數次，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的酚+氯仿+異戊醇（25：24：1），緩慢顛倒混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的氯仿充分混勻，12000r/min離心10min，取上清；加入等體積的冰凍異丙醇，置于-200℃冰箱中30min；12000r/min離心10min，棄上清液；用800μL70%乙醇漂洗2次，風干；用50μL無菌水溶解DNA，置于-200℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR擴增體系及程序 PCR擴增體系（20μL）：正、反向引物（10μmol/L）各0.6μL，10×Buffer2μL，dNTPs（2mmol/L）2μL，MgSO₄（25mmol/L）1.2μL，KOD酶（1U/μL）0.4μL，50ngDNA模板1tμL，ddH₂O12.2μL。

反應程序：94℃預變性3min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸10min；4℃保存。

1.2.3 PCR產物檢測及回收 將PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進行水平電泳，電泳電壓130V，時間15min。電泳結束后在凝膠成像儀進行觀察并拍照。

在紫外光下對照Marker觀察電泳結果，用干凈的小刀從膠板上切下目的條帶。使用Axygen瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒對目的DNA片段進行回收與純化，方法詳見說明書。

1.2.4 F₁代雜種鑒定 對上述純化目的DNA片段進行酶切反應（10μL）：膠回收產物5μL、限制性內切酶Hindm0.3μL、10×M Buffer（M Buffer為內切酶對應的Buffer）1μL、ddH₂O 3.7μL。37℃酶切5h。電泳觀察酶切片段的位置和大小。

酶切條帶表現為父母本雜合帶型的F₁代植株為真雜種，僅含有母本條帶的為假雜種。

2 結果與分析

2.1 親本間SNP位點篩選及引物設計

利用對魯花14、Tifrunner及四粒紅高通量測序及SNP分析的結果，從花生基因組中選取一段序列，該段序列中含有特異的SNP位點（圖1），該位點在魯花14與Tifrunner中表現為胞嘧啶（C），而在四粒紅中則突變為胸腺嘧啶（T）。該SNP位點前后6個堿基恰好為限制性內切酶HindⅢ所能識別的酶切位點AAGCTT，而在四粒紅中則由于突變為T不能被HindⅢ識別。

以此段序列為模板，在其兩端設計正向引物TTTGCCAAGAGTACAAGCACA、反向引物CG-CAAGTAGTITCGCAAATG，該引物擴增目的片段大小為755bp。

2.2 DNA質量及產物特異性檢測

由于花生葉片中含有較多的次生代謝物及糖類雜質，本試驗在CTAB使用前加入2%β-巰基乙醇可有效地防止次生代謝物質使DNA變色，同時在抽提的過程中多使用一次氯仿可以有效去除葉片中的蛋白質，從而得到雜質較少的DNA（圖2A）。以此DNA為模板進行擴增，可有效、特異地擴增出目的條帶（圖2B）。

2.3 F₁代真假雜種鑒定

利用限制性內切酶HindⅢ分別對4個雜交組合的F₁代擴增產物進行酶切鑒定，部分材料的鑒定結果見圖3。魯花14、Tifrunner與四粒紅雜交組合的F₁代后代中，由于從魯花14或Tifrun-ner基因組序列獲得的片段具有HindⅢ的識別位點，因而擴增產物能夠切出395bp和362bp兩條片段，兩條片段大小非常相近，故電泳只顯示為一條帶；而從四粒紅基因組獲得的片段不具有HindⅢ識別序列，故只有一條755bp的帶。因此，真雜種具有父母本的帶型，電泳顯示為兩條帶，而假雜種僅表現出母本的帶型，電泳顯示為一條帶。統計并計算各雜交組合的真雜種率（表1），魯花14與四粒紅正、反交組合的真雜種率分別為10.5%與25.9%，低于Tifrunner與四粒紅正、反交組合的真雜種率。

3 結論與討論

目前，花生真假雜種的鑒定往往采用形態學觀察結合DNA分子標記技術。DNA分子標記雖然具有多態性高、檢測靈敏等優點，然而利用分子標記進行雜種鑒定時，對DNA的質量要求較高，需要開發篩選多對引物，因此鑒定過程較為繁瑣，不利于大規模的后代鑒定。本研究采用高通量測序技術及生物信息學分析方法，開發出有效的SNP位點，首次鑒定了四粒紅與魯花14、Tifrunner的雜交后代。該方法既能快速有效、省時省力地鑒定花生基因型及真假雜種，又可為建立花生連鎖圖譜做準備，具有潛在的應用價值，為高效利用花生種質資源奠定了基礎。