快速高效的半邊蓮組織培養體系研究

劉柏玲　李守潔　張凱　郭志軍　張香蕊　王康滿　侯元同

摘要：為保護和利用半邊蓮種質資源，建立快速高效的組織培養體系，本研究以野外采集的半邊蓮頂芽和莖段為外植體，利用Ms培養基為基本培養基，添加不同濃度的6-BA和NAA，研究半邊蓮合適的芽誘導和生根培養基。結果表明，半邊蓮的最適芽誘導和生根培養基分別為Ms+2.0mg/L6-BA和Ms+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，其芽誘導率和生根率分另0為97.0%和95.5%，組培苗長勢好，移栽成活率達100%。本研究建立了半邊蓮快速高效的組織培養體系，為其資源的保存和利用提供了技術保障。

關鍵詞：半邊蓮；組織培養；芽誘導率；生根率

中圖分類號：S567.23⁺9+Q813.1⁺2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0018-03

半邊蓮Lobelia chinensis是桔梗科Campanu-laceae半邊蓮屬Lobelia多年生草本植物，具利尿消腫、清熱解毒之功效，常用于治療癰腫疔瘡、臌脹水腫、濕熱黃疸、濕疹濕瘡、蛇蟲咬傷等，民間有“識得半邊蓮，不怕同蛇眠”之說，是《中國藥典》2010年版收錄的常用中藥品種。半邊蓮又因其植株低矮、分枝多、葉密集、花形獨特、色澤艷麗、觀賞價值高而成為花壇、園林鑲邊、組合盆栽和觀賞草坪的常用植物。半邊蓮在《山東植物志》和《山東植物精要》中的記錄分布地區僅在肥城、臨沂和棗莊，通過微山縣的藥用植物調查發現濟寧為半邊蓮的新分布區域。由此可見，半邊蓮在山東省內分布較稀少，值得對其進行原地或遷地保護。半邊蓮的應用價值被逐漸發掘，而其生長環境人為破壞嚴重致使野生資源匱乏，因此利用組織培養技術研究半邊蓮的離體繁殖和種質保存就顯得尤為重要。近年來，有人對半邊蓮組織培養進行了相關的研究，如阮淑明對半邊蓮頂芽和莖段進行培養；譚興等利用TDZ誘導半邊蓮進行離體快速繁殖；王廣軍以半邊蓮的莖段和葉片誘導愈傷得到再生植株。本試驗在前人研究基礎上簡化其培養過程，利用半邊蓮的頂芽和莖段在添加6-BA和NAA的MS培養基中成功培養后再移栽，建立了簡單、快速、高效的半邊蓮組織培養體系，可為工廠化大量繁殖半邊蓮植株提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

半邊蓮于2014年4月采自于微山縣薛河大橋東北側，并成功種植在曲阜師范大學植物學實驗室。選取長勢良好的半邊蓮頂芽和帶腋芽的莖段作為試驗材料。

以MS培養基為基本培養基，添加3%的蔗糖、0.6%的瓊脂，pH值用1mol/L的NaOH調至5.8～6.0，高壓滅菌（1.1MPa、121℃）20min。培養溫度為（25±1）℃，光照強度為1500～2000lx，光照12h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消 毒取半邊蓮頂芽和帶腋芽的莖段，加適量洗潔精清洗后流水沖洗15min，置于超凈工作臺；70%乙醇消毒10s后無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞（HgCl₂）溶液消毒1min，期間不斷搖勻；最后用無菌水沖洗3～5次，每次2～3min，無菌濾紙吸干外植體表面的水分，頂芽切掉基部、莖段切成1.0cm左右備用。

1.2.2 初代和芽誘導培養 經消毒的外植體接種到MS初代培養基中，30d后接種到芽誘導培養基中，30d后統計芽誘導率，芽誘導率（%）=產生芽的外植體數/接種外植體數×100。每處理培養10瓶，每瓶4個外植體，重復3次，試驗結果為3次重復的平均值（下同）。

1.2.3 生根培養 將2～3cm左右的芽切下，移至生根培養基中，30d后統計生根率、根數量和根長。生根率（%）=（生根的芽數量/接種芽數量）×100。

1.2.4 馴化移栽 移栽前打開瓶蓋進行煉苗，瓶內加入少量自來水，在培養室內放置2d。然后取出組培苗，洗凈根部的培養基，定植于含腐殖土的小容器中，適當遮蔭保濕。

1.3 數據分析

利用SPSS19.0統計分析軟件進行方差分析和Duncans檢驗。

2 結果與分析

2.1 半邊蓮的初代培養

在本研究中，半邊蓮外植體在MS培養基中培養即能使頂芽和腋芽萌發，10d左右外植體基部開始形成根系，30d左右即能形成4～5cm長的小苗。

2.2 6-BA對半邊蓮芽誘導的影響

為繁殖大量的組培苗，將半邊蓮初代培養的莖段接種到芽誘導培養基（表1）中，30d后統計誘導率。結果表明：三種培養基的芽誘導率都較高，并且都能使試管苗長高、增粗。MS+2.0mg/L6-BA培養基中的芽誘導率和試管苗高度顯著高于其它處理，芽誘導率達97.0%，平均苗長為4.7cm，并且能形成少量的根系（圖1A）。

2.3 生根培養

為得到根系生長良好的組培苗，在MS+2.0mg/L6-BA培養基中再添加不同濃度NAA使組培苗進一步生根（表2），2周后統計根的生長狀態。結果表明：三種培養基的生根率都在90%以上，并且都能使根伸長。試管苗在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA培養基中生根明顯優于其它兩個處理，根的總體生長狀態最好，生根數量多，平均根長最長，達4.8cm（圖1B）。

2.4 移栽

在生根培養15d以后，每株試管苗都形成良好的根系，并且有白色的根毛，達到移栽標準。煉苗2d后，將試管苗基部的瓊脂清洗干凈再進行移栽，適當保濕和遮蔭，移栽成活率可達100%（圖1C）。

3 討論與結論

本研究采用半邊蓮的頂芽作為外植體時，更易于誘導產生組培苗，并且長勢更好，這可能是頂芽組織幼嫩、不含毒素、生長速度更快的原因。在園藝植物組培進行脫毒苗的生產時大多利用植物的頂芽或莖尖作為外植體。

半邊蓮在MS基本培養基中能形成組培苗，說明半邊蓮在離體培養下較易成活，但在培養基中添加植物激素后，生長速度更快，組培苗長勢更好，提高了其繁殖效率。植物激素是植物組織器官分化的關鍵因素，形成器官的類型是由培養基中不同激素的相對濃度控制，而不是絕對濃度。6-BA是細胞分裂素，誘導芽的分化；NAA是生長素，促進生根。前人研究結果表明，6-BA/NAA的比值高時有利于不定芽的分化，而比值低時有利于不定根的形成，本研究結果和前人結論相似，最佳芽誘導培養基為MS+2.0mg/L6-BA，最佳生根培養基為MS+2.0 mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

半邊蓮的試管苗從無菌、營養好、光照和溫度適宜的條件轉移到自然條件下需經歷一個煉苗的過程，使它們逐漸適應外界環境，從而保證移栽的成活率。在保證空氣濕度以及適當遮蔭條件下，成活率達100%。

本研究建立了半邊蓮快速高效的組織培養體系，從外植體到移栽成活整個周期為6周左右，繁殖速度快、繁殖系數高。半邊蓮組織培養體系的建立為其資源的保存和利用提供了技術保障，從而可以規模化地利用這一觀賞和藥用價值兼具的濕地植物。