高效液相色譜法同時測定百華花楸果實中金絲桃苷和蘆丁的含量

孟令鍇 張朝立 高長久 等

[摘要] 目的 建立同時測定百華花楸果實中金絲桃苷和蘆丁含量的高效液相色譜分析方法。 方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速1.0 mL/min，檢測波長363 nm，柱溫30℃。 結果 金絲桃苷和蘆丁分別在0.1～0.8 μg和0.16～1.28 μg范圍內，進樣量與色譜峰面積呈良好線性關系，相關系數分別為0.9994和0.9992；平均回收率（n = 9）分別為98.58%和98.22%，RSD分別為1.71%和1.81%；平均含量分別為0.473、0.342 mg/g。 結論 該法操作簡便、準確，穩定性及重復性好，可用于對百華花楸果實中金絲桃苷和蘆丁成分的含量測定。

[關鍵詞] 百華花楸；金絲桃苷；蘆丁；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0032-05

HPLC determination of content of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis

MENG Lingkai1 ZHANG Chaoli1 GAO Changjiu1 LI Jie2

1.Natural Medicinal Chemistry and Pharmacognosy Teaching and Research Section， Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of Hematology， the Affiliated Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College， Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To establish HPLC method for the determination of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis. Methods The Zorbax SB-C18 （5 μm， 4.6 mm×250 mm） column was adopted and eluted with mobile phase consisted of methanol∶acetonitrile∶0.025 mol/L aqueous phosphoic acid （10∶20∶70） at the column temperature of 30℃. The flow rate was 1.0 mL/min and detective wave length was 363 nm. Results Hyperoside was proved to be linear in the range of 0.16-1.28 μg with a regression coefficient of 0.9992， the average recovery was 98.22% with RSD of 1.71%； Rutin was proved to be linear in the range of 0.1-0.8 μg with a regression coefficient of 0.9994， the average recovery was 98.58% with RSD of 1.81%. The average content of hyperoside and rutin was 0.473 mg/g and 0.473 mg/g respectively. Conclusion The developed method is convenient and accurate with high repeatability and stability， which is suitable for the content determination.

[Key words] Srobus pohuashanensis； Hyperoside； Rutin； HPLC method

百華花楸（Srobus pohuashanensis）為薔薇科（Ros-aceae）花楸屬（Sorbus）植物，其果實稱“花楸果” [1]。薔薇科 （Rosaceae）花楸屬（Sorbus）在全世界有80余種，廣產于熱帶及亞熱帶地區，尤其在北半球，系為分布廣闊的大屬植物。我國有50余種，分布于東北、西北和東南等地區。該屬植物民間很早就入藥，藥用的花楸主要有西伯利亞花楸（S.aucu Paria）、百華花楸（S.pohuashanensis）、天山花楸（S.tianshanie）及變種天山毛花楸（S.tianshaniea.var.tomentosa）等[2]。研究表明，花楸屬植物中含有較豐富的黃酮、花青素、類山梨酸苷、生氰苷等成分，具有抗氧化、抗癌、抗輻射、降糖、保護心肌缺血和止咳平喘等藥理作用[2-5]。花楸屬植物的果實也具有較高的藥用價值，研究證實其主要的活性成分為黃酮類化合物，主要為金絲桃苷、蘆丁等活性物質[6-8]。百華花楸產自我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古等地區。民間常以果實、嫩枝葉及莖皮入藥。其果實味苦甘、性平；嫩枝葉及莖皮味苦、無毒，具有清熱利肺、補脾生津之功效[9]。百華花楸在黑龍江省資源豐富，但相關研究卻相對滯后，關于百華花楸的報道多集中在育苗、扦插繁殖等方面。對于其化學成分及藥理作用鮮有報道。近年來，本課題組對百華花楸果實進行了系統研究，已初步探明了其抗炎、鎮咳、平喘等藥效物質基礎及作用機制[10-12]。為了進一步合理開發利用該植物藥材資源，控制其內在質量，本課題組以金絲桃苷和蘆丁作為指標成分，采用高效液相色譜法同時測定其在百華花楸果實中的含量，以便建立一種簡便易行，結果準確可靠的金絲桃苷和蘆丁的測定方法，為該藥材藥用資源的系列開發提供參考資料。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水；金絲桃苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：111521-200303），蘆丁對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200306），其余試劑均為分析純。

百華花楸果實采自黑龍江省牡丹江地區，經牡丹江醫學院天然藥物化學與生藥學教研室吳兆華教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）花楸屬（Sorbus）百華花楸（Srobus pohuashanensis）干燥成熟的果實。

2 方法與結果

2.1 檢測波長的確定

取適當濃度的金絲桃苷與蘆丁混合對照品溶液進行紫外掃描，在200～600 nm波長下，金絲桃苷與蘆丁在363 nm波長處有較強吸收，并且兩峰分離效果較好，故選定檢測波長為363 nm。

2.2 色譜條件的確定

色譜柱：Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相：甲醇︰乙腈︰0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70），流速為1.0 mL/min，檢測波長為363 nm，柱溫為30℃。在本色譜條件下，百華花楸果實中蘆丁和金絲桃苷的色譜峰與其他成分相鄰的色譜峰能夠達到很好的分離，理論塔板數按金絲桃苷和蘆丁色譜峰計算均不低于5000。結果見圖1。

2.3 樣品中金絲桃苷和蘆丁提取方法的考察

稱取百華花楸果實藥材9份，每份5 g，以甲醇超聲提取，選取溶劑用量（A）、提取時間（B）和提取次數（C）為考察因素，每個因素選取3個水平，因素水平表見表1，選用L9（34）正交試驗表安排實驗，以金絲桃苷提取率為考察指標，將結果填入正交試驗表中，進行直觀分析和方差分析[13-15]。由表2、4可知，RC>RA>RB，表明提取率的影響從大到小分別為：提取次數>溶劑用量>提取時間；以蘆丁提取率為考察指標，將結果填入正交試驗表中，進行直觀分析和方差分析。由表3、5可知，RC>RA>RB，表明提取率的影響從大到小分別為：提取次數>溶劑用量>提取時間；通過以上實驗結果，結合直觀分析、方差分析及實際實驗情況，最終確定實驗方案為：20倍提取溶劑，超聲提取3次，每次30 min。

表1 因素水平表

表2 金絲桃苷提取優化正交試驗結果

表3 蘆丁提取優化正交試驗結果

表4 金絲桃苷含量為指標方差分析

注：*表示顯著性

2.4 溶液的制備

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取4.0 mg金絲桃苷對照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解并稀釋定容至刻度，制成160 μg/mL的金絲桃苷對照品儲備液；另精密稱取2.5 mg蘆丁對照品，置于25 mL容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解并稀釋定容至刻度，制成100 μg/mL的蘆丁對照品儲備液；分別精密吸取2 mL蘆丁對照品儲備液和2 mL金絲桃苷對照品儲備液置于10 mL容量瓶中，搖均，甲醇定容至刻度，制成含20 μg/mL蘆丁對照品和32 μg/mL金絲桃苷對照品的混合對照品儲備液。

2.4.2 樣品溶液的制備 稱取百華花楸果實藥材5 g，置于100 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲提取3次，每次30 min，再加甲醇定容至刻度，離心，取上清液經0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.5 線性關系考察

精密吸取金絲桃苷對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項下條件，進樣10 μL，測定峰面積，以峰面積值為縱坐標，對照品量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：Y=4.08×104X +6.68×103，r = 0.9992，結果表明金絲桃苷在0.16～1.28 μg的范圍內呈良好線性關系；另精密吸取蘆丁對照品儲備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項下條件，進樣10 μL，測定峰面積，以峰面積值為縱坐標，對照品量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程Y=3.87×104X+5.79×103，r = 0.9994，結果表明蘆丁在0.1～0.8 μg的范圍內呈良好線性關系。

2.6 精密度試驗

精密吸取金絲桃苷和蘆丁混合對照品儲備液，按“2.2”項下條件，重復進樣6次，每次進樣量10 μL，記錄峰面積，計算日內精密度；連續進樣3 d，計算日間精密度。結果表明，日內精密度：金絲桃苷峰面積值的RSD=0.58%，蘆丁的RSD=0.76%；日間精密度：金絲桃苷峰面積值的RSD=0.77%，蘆丁的RSD=0.87%。以上結果表明儀器精密度較好。

2.7 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.2”項下條件，分別于0、1、2、4、8 h分別進樣測定，記錄金絲桃苷、蘆丁組分峰面積。結果金絲桃苷峰面積值的RSD=0.79%；蘆丁峰面積值的RSD=0.92%，表明金絲桃苷、蘆丁組分在8 h內穩定。

2.8 重復性試驗

取百華花楸果實藥材5 g，按“2.4.2”項下樣品溶液的制備方法進行，平行制備供試液6份，按“2.2”項下條件測定含量，藥材中金絲桃苷和蘆丁的平均含量分別為0.47、0.34 mg/g。RSD分別為1.18%、1.59%。表明方法重復性較好。

2.9 回收率試驗

精密稱取已測知含量的百華花楸果實藥材5 g，按照“2.4.2”項下樣品制備方法制備供試品溶液，吸取供試品溶液2、4、6 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶中，再精密加入高、中、低濃度的金絲桃苷和蘆丁對照品溶液，加甲醇定容至刻度，按“2.2”項下色譜條件進行進樣測定，結果見表6、7。結果金絲桃苷回收率的RSD與蘆丁回收率的RSD均小于2%，表明該方法準確度較高。

表6 金絲桃苷回收率測定結果（n = 9）

表7 蘆丁回收率測定結果（n = 9）

2.10 樣品測定

取百華花楸果實藥材樣品6份，精密稱定，置100 mL量瓶中加甲醇適量，超聲提取3次，每次30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖均，過濾，取濾液再經0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。精密吸取供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2”項下條件測定，記錄色譜峰面積，采用標準曲線記錄含量。結果樣品中金絲桃苷與蘆丁的平均含量分別為0.473、0.342 mg/g；RSD分別為1.29%、1.28%。結果見表8。

表8 含量測定結果（n = 6）

1.蘆丁 2.金絲桃苷

圖1 混合對照品（A）與樣品溶液（B）高效液相色譜圖

3 討論

黑龍江省花楸屬植物資源較為豐富，花楸屬植物果實具有較高的藥用價值，其主要的活性成分為黃酮類化合物，主要為金絲桃苷、蘆丁等活性物質，具有解痙、鎮咳、抗炎、抗病毒等作用。目前，對黑龍江省百華花楸果實相關研究較匱乏，尚未見有同時測定百華花楸果實中金絲桃苷、蘆丁兩組分的文獻報道。本研究采用高效液相色譜法同時測定金絲桃苷和蘆丁的含量，方法簡便易行，結果準確、可靠。可作為百華花楸果實中金絲桃苷和蘆丁的含量測定方法。

本實驗對百華花楸果實中金絲桃苷和蘆丁成分的提取條件進行了優化，分別對提取溶劑用量（10、15、20倍）、提取時間（30、50、70 min）、提取次數（1、2、3次）進行正交試驗，最終確定20倍的甲醇為提取溶劑，超聲提取3次，每次30 min作為最佳提取工藝，該條件下金絲桃苷和蘆丁提取率較高，且方法簡單，經濟實用；在進行金絲桃苷色譜條件優化試驗中，依據資料記載情況[16-23]，分別對甲醇-磷酸；乙腈-水；乙腈-磷酸；甲醇-乙腈-磷酸等多種流動相進行了考察，結果發現以甲醇-磷酸為流動相條件下，金絲桃苷與蘆丁色譜峰不能達到很好的分離，基線漂移嚴重；以乙腈-水為流動相條件下，金絲桃苷色譜峰存在拖尾現象；以乙腈-磷酸為流動相條件下，金絲桃苷色譜峰出現拖尾，且基線不穩；因此選擇甲醇-乙腈-磷酸為流動相；考察了加入不同物質量的磷酸（0.01、0.025、0.05、0.075 mol/L）的實驗結果，發現當加入0.025 mol/L的磷酸進行洗脫時的柱效和分離度最好，并能有效消除拖尾現象，因此最終確定以甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸（10∶20∶70）為最佳流動相。

[參考文獻]

[1] 國家中醫藥管理局.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999：2903-2906.

[2] 于明，李銑.花楸屬植物化學成分、藥理作用及其研究進展[J].遼寧中醫學院學報，2004，6（5）：364-365.

[3] 耿瑋崢，呂銘洋，崔新明，等.天山花楸葉總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌酶和心肌超微結構的影響[J].中國實驗診斷學，2015，19（6）：877-879.

[4] 李樂，仇秀紅，蘇向輝，等.天山花楸乙酸乙酯部位降糖效果研究[J]. 時珍國醫國藥，2014，25（5）：1060-1061.

[5] Termentzi A，Alexiou P，Demopoulos V，et al. Inhibitory effect of Sorbus domesticca fruits extracts on aldose reductase enzyme in correlation to their phenolic content [J]. Phar Mazie，2008，63（9）：8567-8569.

[6] 常軍民，向陽，李毓斌，等.天山花楸藥材質量標準研究[J].新疆醫科大學學報，2013，36（6）：785.

[7] 常軍民，向陽，孟磊，等.高效液相色譜-質譜法同時測定天山花楸枝葉及果實中苦杏仁苷和金絲桃苷的含量[J].中國新藥雜志，2013，22（13）：1578-1586.

[8] 柴小東.百華花楸果實有效成分研究[J].遼寧林業科技，2015，（4）：74-75.

[9] 長春中醫學院革命委員會.吉林中草藥[M].長春：吉林人民出版社，1970：114-115.

[10] 李雪梅，周雪，趙英福，等.百華花楸果實水提取液鎮咳、平喘作用的實驗研究[J].中國醫學裝備，2015，11（1）：118-119.

[11] 侯甲福，李雪梅，李文超，等.百華花楸果實抗炎有效部位的研究[J].中國藥物經濟學，2013，9（5）：225-226.

[12] 侯甲福，劉世娟，劉丹丹，等.百華花楸果實水提物的急性毒性實驗研究[J].中國藥物經濟學，2014，9（10）：221-222.

[13] 芮鳴，唐輝，王魯石，等.天山花楸葉中總黃酮超聲提取工藝研究[J].時珍國醫國藥，2009，20（12）：3038-3040.

[14] 于曉瑾，王振宇，高宇，等.超聲提取百華花楸總黃酮工藝研究[J]. 中醫藥信息，2015，32（5）：27-31.

[15] 林錦鋒，楊志業，李曼莎，等.巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應用[J].中國醫藥導報，2015，12（27）：22-25

[16] 王幻，唐輝，王國軍，等.HPLC 測定天山花楸葉提取物中6 種黃酮成分[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（15）：58-61.

[17] 張薇，常軍民，沈美英，等.RP-HPLC法測定天山花楸果實中苦杏仁苷、蘆丁、金絲桃苷和橙皮苷的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（5）：935-937.

[18] 李景莊，胡君萍，楊建華，等.HPLC-UV法測定天山花楸中金絲桃苷和蘆丁的含量[J].藥物分析雜志，2009， 29（2）：310-312.

[19] 馬曉麗，常軍民，李毓斌，等.毛細管電泳法測定天山花楸中的黃酮類化合物[J].中成藥，2011，33（3）：534-536.

[20] 李毓斌，常軍民，王巖.天山花楸藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中成藥，2011，33（5）：742-745.

[21] 李鳳霞，王鳳儒，李宏偉.高效液相色譜儀對甲硝唑注射液滅菌工藝篩選研究[J].中國醫學裝備，2015，1（2）：37-39.

[22] 宋學英，楊華，趙逸松.高效液相色譜儀的應用分析[J].中國醫學裝備，2015，12（1）：29-31.

[23] 王悅，童建.高效液相質譜法測定大鼠血漿中布洛芬濃度[J].中國醫學裝備，2014，11（B12）：105.

（收稿日期：2015-11-26 本文編輯：趙魯楓）