外周血T淋巴細胞亞群在EV71型手足口病患者病情判斷中的價值

符青松 黃循斌

[摘要] 目的 探討腸道病毒71（EV71）型手足口?。℉FMD）患兒外周血淋巴細胞亞群與病情嚴重程度的相關性。 方法 選取2011年5月～2014年5月在深圳市龍崗中心醫院兒科住院的EV71型HFMD患兒150例，根據《手足口病診治指南（2013 年版）》分為普通組100例、重癥組50例，兩組患兒年齡均為2～5歲；選擇同年齡段的 90例健康兒童作為對照組。采用流式細胞術檢測EV71型HFMD患兒病程第3天及對照組兒童外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分數。重癥組患兒按手足口病診治指南規范治療5 d后再次檢測上述相關指標，并與治療前進行比較。 結果 重癥組外周血T細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分數較對照組及普通組顯著降低，差異均有高度統計學意義（P < 0.01），重癥組CD4+/CD8+比值低于普通組及對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；重癥組患兒經過規范治療后外周血T淋巴細胞亞群百分數上升，但與治療前比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 EV71型HFMD患兒存在細胞免疫功能紊亂，外周血T細胞亞群水平變化可能與患兒病情嚴重程度存在一定程度的相關性。

[關鍵詞] 腸道病毒71型；手足口??；T淋巴細胞亞群；細胞免疫

[中圖分類號] R725.622.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（a）-0113-04

Value of peripheral blood T lymphocyte subsets in condition judgment of HFMD

FU Qingsong1 HUANG Xunbin2

1.Department of Laboratory， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Department of Pediatrics， Longgang Center Hospital of Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the peripheral blood lymphocyte subsets and the severity of the disease in children with enterovirus 71-induced hand， foot and mouth disease （HFMD）. Methods one hundred and fifty cases of enterovirus 71-induced HFMD children from May 2011 to May 2014 in Longgang Center Hospital of Shenzhen City were selected， they were divided into common group （100 cases）， severe group （50 cases） according to Hand Foot Mouth Disease Diagnosis and Treatment Guidelines （2013 Edition）， age of children in two groups was 2-5 years old， 90 healthy children with the same age were selected as the control group. Flow cytometry was used to detect the T cell subsets CD8+， CD4+ and CD3+ in the peripheral blood of children with enterovirus 71-induced HFMD in the third days and control group. The related indexes were detected again after 5 days of treatment in the severe group， they were compared with before treatment. Results The CD8+， CD4+ and CD3+ of T cells in severe group were significantly lower than the common group and the control group， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the ratio of CD4+/CD8+ in severe group was lower than the common group and control group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the peripheral blood T lymphocyte subsets of the severe group after standard treatment was significantly decreased， but there was no obvious difference compared with before treatment （P > 0.05）. Conclusion There are some cellular immune function disorders in children with enterovirus 71-induced HFMD. The changes of T cell subsets in peripheral blood are correlated with the severity of the disease.

[Key words] Enterovirus 71； Hand， foot and mouth disease； T lymphocyte subsets； Cellular immunity

手足口?。℉and，foot and mouth disease，HFMD）是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，具有傳播迅速、傳染性強等特點，引起該病的腸道病毒約有20種，但是其中以柯薩奇病毒A組16型（CoxA16）、腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）為最常見病原體[1-2]，其中EV71具有嗜神經性，感染后易并發無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經源性肺水腫、循環衰竭等嚴重并發癥，其病死率相對較高，幸存者常留有嚴重神經系統后遺癥[3]。自1997年來，EV71感染的手足口病在全球范圍流行暴發，其中以亞太地區尤為嚴重，已造成數百萬人致病，并已造成數百例患者死亡。2008年，我國已報道488 955例該病患者，其中126例病例為死亡病例，并且統計顯示，主要的致病原便是EV71，因此，EV71感染已成為一個公眾的健康問題并引起人們關注[4-6]。但是到目前為止，EV71感染的發病機制并不清楚，并且本病目前無特效的治療方法，因此，深入研究其發病機制對于早期防治本病及評估預后具有重要意義。本實驗通過流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分數，探討其與EV71型HFMD病情嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年5月～2014年5月深圳市龍崗中心醫院（以下簡稱“我院”）兒科住院的HFMD患兒150例為研究組，根據中華人民共和國衛生部頒發的《手足口病診治指南（2013 年版）》診斷標準分為兩組，其中100例患兒無合并癥，作為普通組，男55例、女45例，年齡2～5歲，平均（2.2±1.7）歲；50例患兒出現并發癥，作為重癥組，男29例、女21例，年齡2～5歲，平均（2.6±1.2）歲。對照組：為我院兒?？普ｓw檢兒90例，男56例、女34例，年齡2～5歲，平均（2.8±0.5）歲。各組性別、年齡、體重比較，差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究取得了研究對象監護人的知情同意，研究方案獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 納入標準

①診斷符合國家衛計委頒發的《手足口病診治指南（2013 年版）》診斷標準，2011年5月～2014年5月于我院兒科住院的HFMD患兒；②咽拭子標本利用實時熒光PCR技術確定病原為EV71或大便病毒檢查明確病原為EV71的患兒；③肝腎功能均正常的患兒；④乙肝和丙肝病毒血清指標顯示陰性的患兒。

1.3 排除標準

①合并其他病毒感染性疾病的患兒；②就診時病程≥3 d的患兒；③正在使用糖皮質激素或細胞毒性藥物治療的患兒。④有免疫抑制劑和激素使用史的患兒；⑤有腫瘤、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病的患兒；⑥有家族性疾病史及傳染病史的患兒。

1.4 觀察指標及檢測方法

對各組研究對象T淋巴細胞亞群表達水平進行統計比較，并分析其與HFMD發病的關系。

EV71型HFMD患兒病程第3天及對照組兒童清晨空腹抽取靜脈血2 mL，緩慢注入含有EDTA抗凝管中。管中依次加入3種抗體10 μL，室溫避光孵育25 min，每管加入200 μL溶血素，輕輕吹打，在室溫下避光靜置15 min，裂解紅細胞，觀察溶液澄清透明后，加入預冷PBS液1 mL，室溫下分離血清（3000 r/min離心10 min），去上清，加入1 mL PBS液搖勻，滴加1%多聚甲醛液100 μL固定，采用美國BD公司的FACS Calibur 四色流式細胞儀檢測，并用SimulSet軟件自動分析結果，分別得出CD3+、CD4+、CD8+在外周血中的百分數及CD4+/CD8+細胞的比值。

重癥組患兒按手足口病診治指南規范治療5 d后再次檢測上述相關指標，采血保存及測定方法同上。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件對文中所得數據進行統計學分析，計量資料以均數標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血T細胞亞群的變化

EV71型HFMD重癥組T細胞亞群 CD3+、CD4+、CD8+百分數均低于普通組和正常對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；普通組T細胞亞群CD3+、CD4+百分數分別低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），而普通組CD8+T 細胞與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）；重癥組CD4+/CD8+比值低于普通組及對照組，差異均有高度統計學意義（P < 0.01），普通組及對照組CD4+/CD8+比值比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1 各組外周血T細胞亞群檢測結果比較（x±s）

注：與普通組比較，*P < 0.01；與對照組比較，△P < 0.05，#P < 0.01

2.2 HFMD重癥組治療前后外周血T細胞亞群的變化

HFMD重癥組患兒治療后CD3+、CD4+、CD8+百分數上升，但與治療前比較差異無統計學意義（P > 0.05），且組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）；而CD4+/CD8+明顯升高，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 手足口病重癥組治療前后外周血T細胞亞群檢測結果比較（x±s）

3 討論

手足口病是嬰幼兒中常見的一種傳染性疾病，臨床表現為發熱、手、足和口腔等部位出現皮疹和潰瘍，個別嚴重的患者還可出現肺水腫、心肌炎和無菌性腦膜炎等危及生命的并發癥，引起該病的主要原因是腸道病毒，可引起手足口病的腸道病毒有20來種，但以CVA16和EV71為主要病原體。其中EV71感染已經在包括中國在內的多個國家和地區流行[7-8]，比如2008年在中國報道的4 888 955例手足口病病例，其中還包括126例死亡患者病例中，EV71也是最主要的致病菌，因此，EV71感染已成為目前一個重要的公共健康問題。并且，近年來相關研究還表明EV71感染的HFMD在嬰幼兒中發病率較高，尤以3歲以下發病率最高，且易快速進展為重癥病例。輕癥患者表現為自限性手足口病或者皰疹性咽喉炎，而重癥患者可出現肺出血、神經源性肺水腫和腦干腦炎，甚至出現心肺功能衰竭等嚴重后果[9]。這是因為嬰幼兒的免疫功能常處于生理性免疫低下的狀態，因此，嬰幼兒發病率較高，且易進展為重癥型手足口病[10]。EV71感染的發病機制至今尚無明確報道，但有相關研究表明，機體內的某些炎癥因子會在EV71感染后表達水平升高，比如IFN-r、Th2、IL-6、IL-8等，并且這些炎癥因子表達水平的變化與疾病嚴重程度和預后具有相關性[11]，通過對細胞免疫完整的小鼠進行研究也發現，在感染了EV71后，缺乏CD4+和CD8+ T細胞的小鼠更容易發展成為重癥病例，同樣的，通過建立新生小鼠EV71感染模型也發現，感染后IL-6持續升高會引起組織損傷[1]。所有的這些研究均說明了EV71感染致病和發病過程中，細胞免疫具有至關重要的作用，并且目前已有研究表明，在免疫應答過程中，T淋巴細胞有著至關重要的作用[11]。T淋巴細胞根據表型可分為多個亞群，包括CD4+、CD8+ 細胞亞群[12-14]，正常機體下，這兩個亞群的數量和CD4+/CD8+ 比值是保持穩定和相互協調的，以維持機體正常的免疫應答，其中。CD4+細胞主要發揮免疫輔助性細胞的作用，即促進體液免疫和細胞免疫，而CD8+發揮細胞毒性細胞或抑制性細胞的作用，即抑制免疫反應，因此，正常情況下CD4+/CD8+ 比值維持動態平衡，從而使機體免疫功能穩定，這也是機體免疫功能得以發揮的重要前提[15-16]。而當嬰幼兒感染病毒時，T淋巴細胞亞群數量、比例發生異常，機體免疫功能將紊亂[17]，因此，檢測T淋巴細胞亞群對免疫性疾病的發生發展和預后對于臨床的治療和病情的判斷具有重要意義。同時，不同T淋巴細胞亞群在EV71感染手足口病中發揮的不同作用也一直是人們關注的焦點，例如有臨床研究表明，Th17細胞參與了EV71感染的病理過程，而CD4+和CD8+ T淋巴細胞則與手足口病患者的預后有著密切關系[13]，然而，至今為止，尚無EV71感染手足口病患者T細胞亞群變化的系統分析，而且臨床目前也無治療EV71感染的理想的藥物或者防止感染的疫苗，因此，通過本次進一步的研究，將對EV71感染的預防和治療有著指導作用。

1979年，Reinherz等[18]應用雜交瘤技術制備了多種抗人T淋巴細胞單克隆抗體，這使鑒定T淋巴細胞亞群有了最可靠的實驗室指標，其下降則提示該機體免疫功能出現了降低。因此，為探討外周血淋巴細胞亞群變化在EV71型HFMD患兒中的臨床價值，本實驗采用流式細胞術檢測EV71型HFMD患兒外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分數。結果顯示EV71型HFMD重癥組患兒外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+ 百分數及CD4+/CD8+ 比值均低于普通組和對照組，組間比較差異均有統計學意義?？陆鄣萚19]研究亦表明隨著病情的加重，CD3+、CD4+、CD8+ 百分數不斷降低。本實驗上述研究結果提示EV71型HFMD患兒普遍存在細胞免疫功能紊亂，其中重癥組細胞免疫功能紊亂更顯著。其機制可能是EV71急性感染后，人類主要組織相容性復合體（MHC-Ⅰ）類分子與CD8+ 分子結合，參與T淋巴細胞受體（TCR）/CD3介導的信號傳導，啟動MHC-Ⅰ類限制型T細胞應答，細胞毒T淋巴細胞活性增強并識別和殺傷病毒感染細胞，在疾病早期即可出現數量減少，隨著病情的進展，可引起CD8+殺傷T細胞的不斷減少，不能有效地清除病毒感染的細胞，導致病情加重[20-21]。同時，CD4+和CD8+亞群數量的減少，會促使B細胞的分化、抗體合成及抑制細胞毒性T細胞活性等功能減弱，體液免疫功能也相應降低，因此，導致免疫反應平衡嚴重失衡，從而造成患者組織損傷。本研究還顯示HFMD重癥組患兒按指南規范治療后活化T細胞比例雖有上升，但與治療前比較無明顯差異；CD4+/CD8+ 比值較治療前顯著升高。表明重癥手足口病患兒細胞免疫功能在短期治療后不能很快恢復，病情好轉后仍需避免合并其他病原體感染。

綜上所述，EV71型HFMD患兒存在細胞免疫功能紊亂，尤其是重癥病例。監測HFMD 患兒CD3+、CD4+、CD8+ 的百分比和CD4+/CD8+ 比值的動態變化，可作為判斷疾病嚴重程度的臨床參考指標。

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（收稿日期：2015-10-19 本文編輯：任 念）