代謝組學技術及其在針灸臨床療效機制研究中的進展

陳勤　吳巧鳳　方劍喬

【摘要】 代謝組學是一種具有整體研究功能的組學研究方法，在針灸學機制研究中具有良好前景。隨著針灸臨床療效機制研究與代謝組學技術結合的不斷深入，尋求一種符合代謝組學研究方法并兼顧針灸效應特點的研究策略顯得尤為重要。筆者對近10年針灸代謝組學研究進展進行分析，并提出針灸臨床療效研究與代謝組學技術結合的幾點建議。

【關鍵詞】 代謝組學； 針灸； 作用機制； 針灸現代化

Progress of Research on the Technology of Metabolism in Acupuncture and Moxibustion/CHEN Qin， WU Qiao-feng， FANG Jian-qiao.//Medical Innovation of China，2016，13（04）：138-141

【Abstract】 Metabonomics is a kind of whole function research group study method， which has a good prospect in the research of the mechanism of acupuncture and moxibustion. Along with the deepening of clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion on the mechanism and metabolic omics technologies combined with and seek a meet the metabonomics research methods and taking into account the effect characteristics of acupuncture and moxibustion research strategy is particularly important. The author of nearly 10 years the metabolism of acupuncture and moxibustion group research analysis， and put forward the clinical therapeutic effect of acupuncture and moxibustion research and metabolic group science and technology combined with some suggestions.

【Key words】 Metabolism； Acupuncture and moxibustion； Mechanism study； Modernization of acupuncture and moxibustion

First-authors address： The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.04.040

代謝組學（Metabonomics）是上個世紀末繼基因組學（Genomics）、轉錄組學（Transcriptomics）、蛋白質組學（Proteomics）之后發展起來的一門新的組學[1-2]。其基本定義“在生物體新陳代謝的動態進程中，通過系統分析生物的體液、組織中的內源性代謝產物譜的變化，來系統研究生物體整體受到外部刺激后的生物狀況和調節功能”。近年來，與診斷學、藥（毒理）學相關的代謝組學研究發展較快，其中具有代表性的有腫瘤、心血管疾病早期診斷，糖尿病發病因素研究，遺傳性疾病研究等[3-7]。

近10年來，國內學者將代謝組學研究手段引入針灸研究領域，并利用代謝組學技術對消化系統疾病、神經系統疾病、風濕免疫性疾病等針灸臨床常見疾病的針灸療效代謝機制進行初步研究。本文對近10年代謝組學在針灸學研究中的進展進行綜述，并提出自己的見解。

1 針灸機制研究與代謝組學技術結合的必要性

代謝組學就是在生物體新陳代謝的動態進程中，通過系統分析生物的體液、組織中的內源性代謝產物譜的變化，來研究生物體整體受到外部刺激后的生物狀況和調節功能。與基因組學、蛋白質組學相比，它所關注的是生物體內基因和蛋白的有效變化所產生的最終代謝物質。代謝組學從最終代謝產物出發，追溯生物體內糖、蛋白質、脂類物質的代謝變化與疾病發生發展過程的關系，不僅可對疾病的衍變做到時-時追蹤，與基因組學和蛋白質組學相比較，在對疾病相關性最強的信息（靶點）篩選上較前兩種組學更為便捷。

針灸治療作為一種外源性刺激，通過刺激生物體不同組織結構（皮膚、肌肉、血管、神經等）誘發信息傳導及生化調節網絡的變化，作用具有多途徑、多層次、網絡化的整體特點。以往的針灸機制研究方法多采用單條或多條途徑、一個或多個靶點的研究方式進行研究，但往往難以涵蓋全部針灸信號系統，正如針灸基礎理論中，經絡的內涵不僅包括腧穴（刺激點），同時還包括“經脈、絡脈、經筋、皮部”等多個信號系統。因此，采用既往的微觀研究方法往往在獲得一組有效信息的同時會遺失針灸效應中其他的重要信息。

從代謝組學的特點來看，它研究的是外源性刺激情況下生物體系（細胞、組織或生物體）調整過程中，基因和蛋白的有效變化所產生的最終代謝物質。能夠通過高通量的代謝物質篩查對針灸的效應產物進行觀察，使研究者在同一時間段內獲取盡可能多的生物信息，為針灸效應的整體化研究提供新的契機。

2 代謝組學技術與針灸機制研究結合研究現狀

筆者通過文獻檢索發現，近10年針灸代謝組學已有一定發展，并形成初步成果，但研究仍存在以下問題。

2.1 研究病種 近10年吳巧鳳等[8]研究團隊利用代謝組學技術開展了較為系統的針灸機制研究，對功能性消化不良患者進行針刺治療并采用核磁共振（NMR）技術進行代謝組學觀察[8-11]，研究結果顯示，針刺組與服用依托必利比較，乳酸、葡萄糖和乙酰乙酸的含量提高，西藥組則主要表現為降低膽堿、亮氨酸/異亮氨酸的水平，說明針灸與藥物治療機理有所不同。其等還利用動物模型先后開展電針治療潰瘍性結腸炎、慢性情緒應激焦慮研究，發現電針能夠調整潰瘍性結腸炎、焦慮模型大鼠的一般狀況，減輕潰瘍性結腸炎大鼠腸道黏膜炎性細胞浸潤，穩定線粒體、內質網等細胞結構同時能夠調節大鼠血漿及大腦皮層代謝物含量[9-10]。但其研究病種集中于消化系統的功能性消化不良與潰瘍性結腸炎，未對針灸臨床常見疾病如胃炎、腸易激綜合征、便秘等進行研究，對針灸治療同類疾病的機制橫向比對造成一定困難。

另外，張景雪等[12]觀察隔藥灸臍針三陰交與針三陰交對原發性痛經患者的血漿與尿液代謝產物影響，結果顯示隔藥灸臍針三陰交組可以直接通過提高一氧化氮、神經降壓素，降低縮宮素、組胺的含量來緩解痛經。Wen等[13]采用基于超高效液相色譜質譜（UPLC擬MS）代謝組學技術分析急性痛風性關節炎大鼠的尿液和血漿，研究結果顯示針刺可以改善急性痛風關節炎大鼠的血漿及尿液內的代謝物水平。任超展等[14]采用不同針刺手法對類風濕性關節炎（RA）家兔進行治療并做代謝組學觀察，研究結果提示熱補針法治療RA使尿液代謝物譜向正常回歸的調控優于捻轉補法、平補平瀉手法治療組。郭玲玲等[15]采用電針對SAMP8小鼠進行治療，觀察血漿、肝腎組織代謝物變化，研究結果提示電針對血漿、肝、腎組織的代謝譜圖分別產生不同影響。以上研究病種分散，涉及到婦科、風濕免疫、神經系統多個方面，對針灸療法的特征信息提取造成困難。

2.2 代謝組研究的標本 隨著代謝組學研究技術的發展，多種生物液體和組織均可用于代謝組學檢測。血漿和尿液樣本由于收集簡單、易于長期檢測和包含大量的代謝信息，已經成為針灸代謝組學研究“整體模式”常用的標本。如吳巧鳳等[11]檢測健康男性針刺前后血漿、尿液代謝物濃度，發現針刺足三里、梁門、巨髎等陽明經穴可提升中糖類物質的濃度和降低乳酸濃度，升高尿液中馬尿酸和氧化三甲胺的含量。陳勤等[16-17]檢測偏頭痛大鼠模型針灸治療前后血漿代謝物，發現少陽經腧穴電針治療能夠降低偏頭痛大鼠血漿谷氨酸、乳酸水平。張景雪等[12]觀察隔藥灸臍針三陰交與針三陰交對原發性痛經患者的血漿與尿液代謝產物影響。Wen等[13]采用基于超高效液相色譜質譜（UPLC擬MS）代謝組學技術分析急性痛風性關節炎大鼠的尿液和血漿代謝物水平。

但應注意，由于血漿或尿液只能代表生物體的平均代謝狀態或代謝組，不能獲得具體組織的代謝狀態，因此代謝組學研究的組織應注意局部與整體相結合。如吳巧鳳等[9]在電針治療潰瘍性結腸炎研究中，檢測大鼠血漿代謝物同時檢測大腦皮層代謝物含量。郭玲玲等[15]采用電針對SAMP8小鼠進行治療，觀察血漿、肝腎組織代謝物變化，研究結果提示電針對血漿、肝、腎組織的代謝譜圖分別產生不同影響。

從研究目的看，疾病的自然病程和針灸效應二者演變是一個動態過程，采用尿液作為研究樣本的代謝組學研究可以在不干擾生物體的情況下完成對生物體內物質變化的客觀觀察，追蹤疾病和治療手段的時-效關系，但尿液作為代謝組學研究樣品，其代謝物含量受飲食、運動及環境影響極大，存在不穩定性，因此在代謝組學“時-效”研究中加入具有穩定特征的代謝樣品（如關節液、腦脊液、組織器官等）的研究策略更具有科學性。

2.3 研究類型 總結近10年針灸代謝組學文獻，僅有2個針灸代謝組學研究觀察了來自于臨床的真實患者。進一步分析臨床試驗所占比較較低的原因，考慮目前代謝組學臨床研究的困難主要來源于以人為研究對象的代謝組學研究混雜因素過多，存在于生物樣品的內在差異導致研究系統的穩定性和可控性降低。但由于不同生物物種之間存在明顯差異，因此以動物實驗為基礎的研究結論需經過多次重復驗證才能夠直接運用于臨床，不僅延長了研究時間，也消耗了大量的人力物力。因此，建立一種嚴謹且可行的針灸代謝組學臨床研究策略，是針灸療效機制研究與代謝組學技術的結合的關鍵步驟。

3 討論

盡管目前代謝組學檢測技術、數據分析方法及數據預處理軟件發展迅速，仍沒有任何一個研究系統能夠完全、準確解釋和分析研究結果的變異性，進一步影響了代謝組學研究結果的可靠性和客觀性，并增加了代謝組學研究的難度[18-19]。

代謝組學研究結果的變異性主要來源于生物樣品的內在差異和檢測方法的系統誤差。在代謝組學研究發展的前期，針對檢測方法、實驗樣品預處理方法等研究較多，目前關于血清、血漿、尿液、關節液、唾液等常見組織液樣品的采集、滅活、儲存、處理和儀器分析過程的基本規范化技術參數已較為成熟，系統誤差已明顯降低。而存在于生物樣品的內在差異處理和矯正仍是臨床研究的一大難題。21世紀以來，以正交信號校正（Orthogonal signal correction， OSC）為代表的，具有濾噪、提高模式識別功能的譜學信號校正技術和數據預處理軟件發展迅速。但不同的軟件對標準品和實際生物樣品圖譜峰對齊的準確度仍存在差異，實際工作中需選擇多種不同軟件處理圖譜，并進行交互驗證，手工核對，降低了代謝組學研究的效率。因此，如何嚴格控制混雜因素對實驗結果的干擾，建立規范、客觀和可信的實驗研究規范是代謝組學應用于臨床研究的重要保障，也是代謝組學結果作為臨床評價指標的前提條件。

筆者從事針灸臨床研究多年，曾有幸參與代謝組學研究工作，在研究過程中發現針灸臨床研究與藥物臨床研究具有明顯差異，因此其研究方法較藥學研究方法應有所區別，現簡述如下，求正同道。

從針灸刺激產生的代謝物質信號看。針灸治療作為一種“外治”法，針灸效應的產生，不同于藥物的干預，其信號強弱取決于內在的疾病和外來的腧穴刺激共同作用，故人體反應能力的高低、疾病狀態對研究結果的影響較其他研究更為顯著。從前期代謝組學技術在針灸機制研究領域運用情況看，針灸確實能夠引起人體血漿、尿液內代謝產物表型改變，而其引起的代謝物質的變化往往與生物信號傳遞、能量轉化等基礎生命過程相關；與藥物實驗相比，針灸刺激引起的代謝物質變化可能缺乏固定的物質特征與量-效關系，而與疾病信號關聯性更高，因此在數據分析時了解疾病的代謝特征尤為重要[10-14]。

在代謝組學研究中，降低生物樣品自身攜帶的與研究目的無關的信號差異，無疑是降低生物樣品變異更好的方法。如在臨床研究中限定研究對象的來源，如住院或門診，疾病亞型與兼雜癥，受試者年齡、性別、人種、體重指數、飲食、活動量、晝夜節律及生理周期等。而在臨床實踐中，必須兼顧患者群體代表性與倫理學要求，不同受試者個體生活習慣上的差異往往難以避免。針對這一情況，目前代謝組學臨床研究多采用健康志愿者作為研究對象或對照；或增加實驗樣本量，降低個體差異對于實驗結果的影響。但筆者認為，以健康志愿者作為對照，并不能完全模擬疾病的休止狀態，而來源于研究對象的生理變異，也應在數據分析同時得到評估；目前代謝組學檢測費用仍較為昂貴，僅靠實驗樣本量的增大來消除無疑會增加實驗成本，降低該研究方法的臨床可行性。

針對以上問題，筆者提出以下建議：首先，在針灸代謝組學臨床研究方案中增加利于結果對比的臨床方法設計。如在穩定性慢病中采用交叉實驗或分層分析、配對分析，在發作性疾病研究中進行重復測量、連續測量，降低受試者個體差異對結果的影響。其次，在臨床研究中增加濾噪和矯正處理。篩選可能影響實驗結果的混雜因素，采用具有濾噪作用的實驗設計方案，如正交實驗設計，同時觀察實驗因素與非實驗因素對實驗結果的影響；通過實驗結果分類，完成主、次要因素分析，進一步進行數據矯正分析，同時可減少不必要的樣本量消耗。再次，選擇合理的研究樣品。從實驗樣品的篩選看，尿液、血液是最容易采集也是最易受飲食、運動、晝夜節律等非實驗因素影響的實驗樣品，因此對于非住院患者、兼雜疾病較多的患者進行尿液、血液代謝組學分析，結論應謹慎。關節炎、組織液等實驗樣品受非實驗因素影響相對較低，在采集條件允許的情況下，可優先考慮采用。必要時，可通過整合代謝組學（Integrated metabonomics）方法[20]，對同一個體的多種生物樣品（尿液、血液、組織液等）進行代謝組學數據比比對和綜合評價，提高代謝組學研究結果的完整性和準確性。最后，治療性研究中，應注重將組學研究數據與臨床療效評價數據相結合，以提高說服力和尋找代謝靶標的成功率。

代謝組學可以在不干擾（采取尿液、唾液等樣本）或有微量干擾（采取血液樣本）生物體的情況下完成對生物體內物質變化的客觀觀察，追蹤疾病和治療手段的時-效關系，反映生物的整體變化，在針灸的機制研究中具有良好的應用前景。代謝組學技術與針灸療法結合的研究策略還有待進一步探索。

參考文獻

[1] Lindon J C， Holmes E， Nicholson J K. So what's the deal with metabonomics？[J].Anal Chem，2003，75（17）：384A-391A.

[2] Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. ‘Metabonomics'： understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[3]許彬，王海龍，魏開華，等.代謝組學分析技術及其在幾類重大疾病研究中的應用[J].分析測試學報，2006，25（5）：128-132.

[4]許國旺，楊軍.代謝組學及其研究進展[J].色譜，2003，21（4）：316-320.

[5]顏賢忠，孫博，杜祥博.代謝組學技術在毒理學研究中的應用進展[J].國際藥學研究雜志，2014，41（4）：379-399.

[6]董哲毅，周偉，華參，等.血清代謝組學技術在2型糖尿病腎病早期診斷中的應用[J].山東醫藥，2010，50（9）：19-22.

[7]凌永昌，劉瑞珍，劉翔，等.贛南地區非綜合征性唇腭裂患者尿液代謝組學的初步研究[J].中國醫學創新，2014，11（34）：105-107.

[8]吳巧鳳，徐世珍，余曙光，等.基于1H-NMR代謝組學的陽明經穴特異性研究[J].時珍國醫國藥，2010，21（10）：2674-2676.

[9]吳巧鳳，楊陽，趙紀嵐，等.基于1HNMR代謝組學技術研究針刺經穴與非經穴治療潰瘍性結腸炎的腦代謝物質基礎[J].北京中醫藥大學學報，2014，37（8）：572-576.

[10]吳巧鳳，周奇志，張琪，等.電針對慢性情緒應激焦慮模型的代謝組學研究[J].浙江中醫雜志，2008，43（11）：661-664.

[11] Wu Q， Zhang Q， Sun B， et al. 1H NMR-based metabonomic study on the metabolic changes in the plasma of patients with functional dyspepsia and the effect of acupuncture[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2010，51（3）：698-704.

[12]張景雪.隔藥灸臍針三陰交與針三陰交治療原發性痛經的代謝組學對比研究[D].濟南：山東中醫藥大學，2013.

[13] Wen S L， Liu Y J， Yin H L， et al. Effect of acupuncture on rats with acute gouty arthritis inflammation： a metabonomic method for profiling of both urine and plasma metabolic perturbation[J].Am J Chi Med，2011，39（2）：287-300.

[14]任超展.熱補針法對RA模型家兔尿液代謝物譜表達調節的研究[D].蘭州：甘肅中醫學院，2014.

[15]郭玲玲.電針對SAMP8小鼠血漿、肝腎組織1H NMR譜圖的影響[D].成都：成都中醫藥大學，2009.

[16]陳勤.少陽經穴針刺治療偏頭痛的代謝組學研究[D].成都：成都中醫藥大學，2009.

[17] Gao Z， Liu X， Yu S， et al. Electroacupuncture at acupoints reverses plasma glutamate， lipid， and LDL/VLDL in an acute migraine rat model： a （1）HNMR-Based Metabolomic Study[J].Evid Based Complement and Alternat Med，2014，2014：659268.

[18]王敏，黃寅，張偉，等.代謝組學信息獲取與數據預處理瓶頸問題探討[J].藥學進展，2014，38（2）：81-88.

[19]夏建飛，梁瓊麟，胡坪，等.代謝組學研究策略與方法的新進展[J].分析化學評述與進展，2009，37（1）：136-143.

[20] Waters N J， Holmes E， Williams A， et al. NMR and pattern recognition studies on the time-related metabolic effects of alpha-naphthylisothiocyanate on liver， urine， and plasma in the rat： an integrative metabonomic approach[J].Chem Res Toxicol，2001，14（10）：1401-1412.

（收稿日期：2015-12-25） （本文編輯：王宇）