綠原酸清潔提取及其體外生物活性評價

王星敏，李 鑫，邵承斌，張 宇

（1.催化與功能有機分子重慶市重點實驗室，重慶400067；2.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶400067）

綠原酸清潔提取及其體外生物活性評價

王星敏1，2，李 鑫2，邵承斌2，張 宇2

（1.催化與功能有機分子重慶市重點實驗室，重慶400067；2.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶400067）

植物纖維組織致密結構阻礙天然生物活性成分綠原酸的溶出，為減少綠原酸溶出的傳質阻力，選取復配酶（纖維素酶和木質素酶）催化水解金銀花葉溶浸獲得綠原酸，并采用DPPH自由基清除法、鐵氰化鉀還原法評價提取物綠原酸的體外抗氧化性。分析酶解金銀花葉后的SEM照片發現，酶能有效破壞植物纖維組織結構，有助于形成內部疏松結構，而金屬離子對酶催化水解活性作用依次為Mg2+＞Na+＞Ca2+＞K2+＞Cu2+；選取纖維素酶-木質素酶酶活比為3∶2的復配酶，在水浴溫度45℃、pH 4的條件下，當復配酶投加量為50 U/g時，在Mg2+誘導催化水解2 g金銀花葉11 h后，綠原酸浸提率達94.68%，比超聲醇提法提高了19.60%，所得綠原酸具備高抗氧化性和還原性，為資源化利用金銀花葉以及綠原酸生產提供了新途徑。

綠原酸；酶促反應；金銀花葉；抗氧化性

綠原酸，1，3，4，5-四羥基環己烷羧酸-（3，4-二羥基肉桂酸酯），又稱“植物鉑金”，是由咖啡酸與奎尼酸組成的羧酚酸，具有抗病毒、降血脂、降血壓等功效［1-3］，常作為護肝益腎，防治心血管系統疾病、糖尿病等有顯著療效的重要藥物的合成原料。綠原酸也是一種有效的酚型抗氧化劑，因其分子式中含有R—OH基［4］，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，可捕獲并中和羥基自由基和超氧陰離子，生成較穩定的半醌式自由基，從而保護組織免受氧化作用的損害［5］。現代科學對綠原酸生物活性的研究已深入到醫藥保健、食品及日用化工等行業。目前綠原酸國際市場需求量超過8 000 t/年，國內達7 000 t/年以上，需求量逐年攀升，其價格隨純度增大而高升。

我國綠原酸提取技術主要有水提法、稀醇法、冷浸法、滲漉法、乙醇回流法等［6-10］，這些技術或多或少還存在能耗大、成本高、污染重、純度低等問題，加之工藝中高溫、強光以及長時間加熱等，加速綠原酸水解及其異構化。關鍵技術的桎梏降低了綠原酸產品品質和國際市場競爭力，高效清潔提取綠原酸越來越引起人們的關注。金銀花葉中綠原酸質量分數約4%，但金銀花葉纖維組織的結晶結構所形成天然屏障阻礙了綠原酸的溶出、擴散［11］。基于此，將酶促反應［12-13］應用于金銀花葉中綠原酸的提取，利用生物催化劑酶的專一性和高效性，研究催化裂解植物纖維組織的酶活性，減少綠原酸擴散、遷移的傳質阻力，高效獲得生物活性完備的提取物綠原酸，為綠原酸的功能特性研究以及金銀花葉資源化利用，提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 原料 金銀花葉，取自重慶市秀山縣的種植農戶。

1.1.2 儀器 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司制造；320-S pH計，KQ-400KDB超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司制造；80-2型高速離心機，上海君竺儀器制造有限公司制造。

1.1.3 試劑 綠原酸（標品），甲醇，冰乙酸（色譜純），乙醇，檸檬酸，磷酸氫二鈉，抗壞血酸VC，鐵氰化鉀（分析純），國藥集團化學試劑有限公司經銷。纖維素酶（1 000 U/g），北京奧博星生物技術有限公司制品；木質素酶（1 400 U/g），海林萬力達集團公司制品。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸的浸提

1）酶催化輔助浸提方法：分別稱取120目金銀花葉2 g左右置于250 mL的錐形瓶中，投加20～200 U/g的復配酶 （纖維素酶和木質素酶的質量比為1∶1～3∶1），金銀花葉與水比例為1∶10（g/mL），調節pH值為4，于35℃水浴溫度下搖床酶解2～14 h后，加入體積分數為62.5%的乙醇，固態原料質量1 g∶12 mL，經100 W超聲波于30℃超聲浸提30 min后過濾，分別收集濾渣和濾液，濾液即含有綠原酸［11］；濾渣集中收集后待二次利用。其中，酶解溫度、固液比（g/mL）、體系pH值的參數值是利用均勻設計法分析及實驗驗證所得（另作報道）；本文著重探討的酶催化活性影響因素及考察范圍為：復配酶質量比為1∶1～3∶1，復配酶投加量為20～200 U/g，酶解時間為2～14 h；金屬離子主要考察Mg2+、Na+、Ca2+、K2+、Cu2+等的影響。

2）超聲醇提方法：超聲醇提法主要考察非酶催化輔助的超聲作用下的綠原酸浸提能力。其中，除復配酶投加量為0 U/g、水浸泡時間為11 h外，其余參數與酶催化浸提方法中參數一致。

1.2.2 綠原酸的檢測 采用高效液相色譜法［14］測定綠原酸質量濃度，檢測溶浸液中主要成分。條件：色譜柱為C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相是V（甲醇）∶V（冰乙酸）∶V（超純水）為18∶1∶81，體積流量0.8 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL，檢測波長327 nm。繪制標準曲線

金銀花葉中綠原酸溶出率

式（2）中，c為酶解后溶出的綠原酸質量濃度，取平行樣均值，g/L；V為浸提液體積，mL；N為浸提液測定前稀釋倍數；m為金銀花葉質量，g；4.5%為當批次金銀花葉中綠原酸的質量分數，即采用傳統化學法［12］多次浸提直至綠原酸質量濃度檢測為零時的所有量加和與金銀花葉質量的比值。

1.2.3 酶解后底物SEM掃描及圖像分析 制備樣品固定于樣品臺，經離子濺射儀上真空干燥、鉑噴鍍后，于掃描電子顯微鏡下觀察、拍攝取圖。電鏡工作電壓為5 kV，放大2 000倍。

1.2.4 綠原酸清除DPPH·的活性分析 準確量取0.1 mL不同濃度的綠原酸浸提液，與 2.9 mL 0.017 mg/mL DPPH·-甲醇溶液混勻后，在暗處靜置30 min，采用紫外分光光度計法，以甲醇作為參比液，于517 nm處測定待測樣品加入前后DPPH·-甲醇溶液的吸光度［15］，通過DPPH·吸光度的改變量，評價綠原酸的抗氧化能力，清除率

式（3）中，A0為甲醇＋DPPH·-甲醇溶液的吸光度；As為樣品液 ＋DPPH·-甲醇溶液的吸光度；Ab為樣品液＋甲醇的吸光度。

1.2.5 綠原酸還原能力分析 采用鐵氰化鉀還原法［15］評價綠原酸還原能力。在不同濃度的綠原酸浸提液中加入2.5 mL 0.2 mol/L、pH 6.6的磷酸鹽緩沖液，加入2.5 mL 100 g/L的三氯乙酸，離心取上清液2.5 mL，加2.5 mL H2O、0.5 mL 1 g/L的FeCl3，于700 nm波長測定吸光度，評價綠原酸還原能力。

2 結果與分析

2.1 酶催化活性對綠原酸溶浸的促進作用

2.1.1 促進綠原酸溶浸的不同配比酶活性比較

金銀花葉中木質素和半纖維素交聯形成網狀結構，將纖維素包埋其中，形成天然屏障阻礙綠原酸溶出及擴散。分析金銀花葉組分及其結構，選用纖維素酶和木質素酶，探討不同配比復配酶對綠原酸溶浸的影響。由圖1可知，纖維素酶對綠原酸酶解溶浸能力雖略優于木質素酶，但纖維素酶和木質素酶協同溶浸綠原酸效果明顯優于各單一組成酶，原因在于纖維素酶由C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶組成，C1酶破壞著纖維素的結晶結構，Cx酶是分解β-1，4-糖苷鍵的纖維素酶，β葡糖苷酶可以將纖維二糖、纖維三糖及其他低分子纖維糊精分解為葡萄糖；纖維素酶的這種復雜酶系分步協同并保障促進了對纖維組織的水解；而木質素酶可強化對木質素的降解，從而增大纖維素酶進入并水解底物中纖維素，二者協同作用，加大催化活性中心與底物的結合幾率，提高水解能效。即，當纖維素酶與木質素酶的質量比為2∶1（酶活比為3∶2）時，金銀花葉中綠原酸浸提率達最大值89.8%。此外，超聲醇提所得綠原酸浸提率為78.81%，明顯低于任一單一酶或復配酶催化作用下的綠原酸浸提率，表明酶催化水解有助于提高綠原酸的提取率。

圖1 不同復配酶配比對綠原酸溶浸的影響Fig.1 Effect of different mass ratio of emzyme on chlorogenic acid extraction

對比分析超聲醇提處理和復配酶催化水解后的金銀花葉的SEM照片（圖2）可知，超聲醇提后金銀花葉（圖2（a））表面雖有空隙，可見部分濁蝕，但葉體連續；經酶催化水解處理后的金銀花葉 （圖2（b））組織間孔隙較大，且葉體斷層清晰，內部結構疏松，表面濁蝕現象明顯。表明酶與底物結合，能催化裂解植物纖維組織，達到破壞植物纖維組織的結晶結構的目的，從而提高了綠原酸破壁溶出、運移、擴散的能力。

2.1.2 復配酶投加量對綠原酸溶浸的影響 酶催化活性中心與底物的結合數量，影響單位時間酶反應速度［16］。為進一步提高綠原酸溶浸能效，探討纖維素酶和木質素酶的酶活比3∶2時復配酶不同投加量對綠原酸溶浸的影響。由圖3可知，相同條件下，當復配酶投加量為50 U/g時，綠原酸溶浸效果最好，浸提率可達90.24%，表明單位時間里適當的酶投加量可增大酶與底物結合幾率，從而增加被催化水解的植物組織，綠原酸浸提率得以提高。原因在于纖維素酶中水解次要地位的外切型-β-葡糖苷酶（CBH）組分的水解程度依賴于內切型-β-葡糖苷酶（EG）水解所產生的非還原糖端基；酶投加量適量時，EG組分與底物結合充分，CBH組分的水解程度隨之加快，有利于水解；隨著投加量的增加，水解程度相對減緩；當投加量增加至過于飽和時，底物吸附位置趨于有限，導致EG水解逐漸停止，而CBH組分占主導作用。此外，當酶投加量為0 U/g，超聲醇提所得綠原酸浸提率為79.16%，明顯低于任一酶催化作用下的綠原酸浸提率，表明酶催化水解有助于提高綠原酸的提取率。

圖2 金銀花葉SEM掃描圖片Fig.2 Scanning electron micrographsofLonicera japonica leaf

圖3 不同酶投加量對綠原酸溶浸的影響Fig.3 Effect of different amount of enzyme on chlorogenic acid extraction

2.1.3 復配酶催化水解活性隨時間的變化 酶與底物結合形成ES構型需要一定的作用時間，酶活性及其催化水解反應過程均與酶解時間相關聯，復配酶投加量為50 U/g時，探討綠原酸浸提率隨酶解時間的變化。由圖4可知，隨著復配酶與底物作用時間的延長，綠原酸浸提率隨之增加，當酶解時間為11 h時，體系中綠原酸浸提率可達92.46%。這說明木質素和半纖維素的交聯形式雖影響纖維素酶水解纖維素大分子，但木質素酶與纖維素酶協同作用，因酶的專一特性，同時強化植物纖維中纖維素和木質素的降解，但在這過程中，纖維素酶與木質素酶的協同催化既是連續進行的過程，也是分別作用的過程，故存在時間滯后現象；加之底物中其他組分伴隨綠原酸的溶出而溶出，不僅引發綠原酸擴散及傳質阻擾［17］，其中底物含有的金屬離子也會增大對酶活性的抑制作用，從而導致綠原酸浸提率降低。

圖4 復配酶隨時間對綠原酸溶浸的影響Fig.4 Effect of different time on extraction of chlorogenic acid

2.1.4 不同介質環境促進酶催化水解 金屬離子

常常在代謝酶的協同調控中發揮作用［18-19］。金屬離子對酶活性作用，主要通過金屬離子與酶產生底物形變，誘導底物分子內敏感鍵更加敏感，產生“電子張力”發生形變，從而增強或抑制酶活化能力。對比圖5中各金屬離子對復配酶的相對活力可知，當投加50 U/g的復配酶酶解11 h時，不同金屬離子作用的酶活力差異較大，其對酶催化性能的促進作用依次為Mg2+＞Na+＞Ca2+＞K2+＞Cu2+，表明K+和Cu2+溶液體系中復配酶的酶活性相對受到抑制，而堿金屬或堿土金屬，如Na+、Mg2+或Ca2+則有較明顯的促進作用，其中Mg2+誘導作用下，酶催化水解浸提綠原酸浸提率可達94.64%。

圖5 不同金屬離子對綠原酸溶浸及酶活力的影響Fig.5 Effect of different metal ion on extraction of chlorogenic acid

2.2 綠原酸的抗氧化性分析

2.2.1 綠原酸清除DPPH·能力評價 DPPH自由基清除法是評價抗氧化活性高低的一種目前常用的方法，其效果能體現抗氧化劑給出氫原子的能力。當有自由基清除劑存在時，DPPH自由基捕捉一個電子與游離電子配對，生成穩定的分子態DPPH2［20］，如圖6所示，致使深紫色溶液褪色，其褪色程度與自由基清除劑的數量和清除能力呈定量關系。對比圖7不同純度綠原酸與抗壞血酸對DPPH·清除能力可知，綠原酸清除DPPH·能力明顯強于抗壞血酸，能使自由基成為更為穩定的物質，從而終止有害自由基的鏈式反應；且清除DPPH·的清除速度很快，粗提物清除率達84.2%，純度98%綠原酸清除率達86.78%。由圖8可知，當反應15 min以后，清除自由基的趨勢變得平緩，直至 25 min及以后，DPPH·清除率可達91%。由此可以看出，綠原酸能中斷自氧化鏈式反應，使自由基成為更穩定的物質，在一定質量濃度范圍內，純度越高，所生成的穩定物質越快也越多。

2.2.2 綠原酸還原能力分析 還原能力的測定，可檢驗受試物是否為良好的電子供應者，通過體系溶液顏色改變（所供應電子使Fe3+還原為Fe2+），反映出體系中氧化還原狀態的改變。對比分析純度98%綠原酸、純度95%綠原酸、綠原酸粗提物以及抗壞血酸加入化合物后在700 nm處的吸光度值，由圖9可知，質量濃度低于0.01 mg/mL時，綠原酸的吸光度值均低于抗壞血酸，說明低質量濃度下綠原酸還原能力比較差；但隨著其質量濃度及純度的增大，純度95%綠原酸、純度98%綠原酸、綠原酸粗提物的吸光度值增大，并在實驗范圍內表現出良好量效關系，表明綠原酸可作為電子提供者與自由基反應，具有良好的還原能力，純度越高，還原能力越強。

圖6 DPPH 自由基轉化為DPPH2示意圖Fig.6 Conversion of DPPH free radicals to DPPH2

圖7 不同純度綠原清除DPPH·隨質量濃度變化Fig.7 Comparison of different purity of chlorogenic acid on DPPH·scavenging effect with mass concentration

圖8 綠原酸清除DPPH·的時間變化Fig.8 Comparison of chlorogenic acid on DPPH· scavenging effect with different time

圖9 不同純度綠原酸清除還原能力比較Fig.9 Comparison of reduction ability of different purity of chlorogenic acid

3 結語

應用纖維素酶和木質素酶協同催化水解金銀花葉植物組織浸提綠原酸，對比分析酶解前后金銀花葉SEM照片發現，酶催化水解能有效破壞金銀花葉植物組織結晶結構，有助于植物內部形成疏松結構，減少綠原酸溶出阻力。分析獲得不同組配的溶出綠原酸的纖維素酶和木質素酶的組配，以及不同價態金屬離子對酶催化活性的影響。實驗表明：在Mg2+誘導作用下，纖維素酶-木質素酶酶活比為3∶2的復配酶50 U/g，于水浴溫度45℃、pH 4的條件下催化水解2 g金銀花葉11 h后，綠原酸浸提率達94.68%，比超聲醇提法的提高19.60%。采用DPPH自由基清除法、鐵氰化鉀還原法評價提取物綠原酸的體外抗氧化性，發現浸提綠原酸具備較高的抗氧化性，清除DPPH·能力明顯強于抗壞血酸；也是良好的電子供應者，且隨著質量濃度及純度的增大，其還原能力增強，為資源化利用金銀花葉以及綠原酸生產應用提供了新的途徑。

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Eco-Friendly Extraction of Chlorogenic Acid from Lonicera Japonica Leaves and Its Biological Activity Evaluation in vitro

WANG Xingmin1，2，LI Xin2， SHAO Chengbin2， ZHANG Yu2
（1.Key Laboratory of Catalysis Science and Technology of Chongqing Education Commisssion，Chongqing Technology and Business Universtiy，Chongqing 400067，China；2.College of Environment and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business Universtiy，Chongqing 400067，China）

The chlorogenic acid was a natural bioactive ingredient which was usually hindered in the dense structure of plant fibers and difficult to be extracted.An enzymatic cell wall-breaking process was thus developed using the combination of cellulase and ligninase to reduce transfer resistance during extraction and to improve the extraction efficiency of chlorogenic acid from Lonicera japonica leaves.The antioxidant activity in vitro of chlorogenic acid was evaluated by DPPH free radical scavenging method and ferricyanide reduction analysis.The product of enzymatic hydrolysis by the dual-enzyme complex was characterized by SEM.The complex was confirmed to effectively destruct the plant fiber structure and help to form the internal loose structure.The effect of various metal ions on the enzyme activity were weakened in the order of Mg2+，Na+，Ca2+，K+，and Cu2+.The optimized extraction condition was determined using 3∶2 of cellulase to ligninase ratio （U/U）with50 U/g of enzymes/substrate and Mg2+at 45℃and pH 4.0 for 11 h.Under the optimal condition，the extraction rate of chlorogenic acid could reach as high as 94.68%，which was 19.60%higher than that of ultrasound-assisted ethanol extraction.The anti-oxidative of reductive activities of chlorogenic acid were improved.This study provides a theoretical foundation to the comprehensive utilization of Lonicera japonica leaves and industrialization of chlorogenic acid.

chlorogenic acid，enzymatic reaction，Lonicera japonica leaf，antioxidant activity

TQ 09

A

1673—1689（2016）010—1081—07

2015-01-19

重慶市科技攻關項目（cstc2013yykfB20001）。

王星敏（1975—），女，重慶人，工學博士，教授，主要從事農業廢棄物資源化利用及健康產品開發研究。E-mail：wang_chem@tom.com