高產γ-氨基丁酸酵母菌的篩選、鑒定及優化

肖 婧，徐亞男，李 琦，張彥位，劉 研，史學偉*

（1.石河子大學 信息科學與技術學院，新疆 石河子832000；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000）

高產γ-氨基丁酸酵母菌的篩選、鑒定及優化

肖 婧1，徐亞男2，李 琦2，張彥位2，劉 研2，史學偉*2

（1.石河子大學 信息科學與技術學院，新疆 石河子832000；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000）

從新疆特色食品中篩選出能產γ-氨基丁酸的酵母菌菌株，并對其發酵條件進行優化。采用非釀酒酵母菌分離純化的方法分離出非釀酒酵母菌，再通過初篩、復篩及誘變挑選出高產γ-氨基丁酸的菌株，并對其進行形態學及26S rRNA基因分析，最后對菌株產γ-氨基丁酸的發酵條件進行優化。經26S rRNA基因序列分析鑒定為葡萄汁有孢漢生酵母XYN019（H.uvarum XYN019）；通過紫外誘變產量提高了2.3倍，最佳誘變時間為30 s，誘變濃度為10-5；優化后的理論發酵條件為培養溫度33.95℃，pH值5.01，培養時間49.17 h，接種量為體積分數3.17%，其γ-氨基丁酸質量濃度達到4.926 g/L。以上結果表明，該菌株可作為γ-氨基丁酸產生菌，具有較好的γ-氨基丁酸生產潛力。

γ-氨基丁酸；分離篩選；鑒定；非釀酒酵母菌

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）又稱氨酪酸，是一種天然存在的非蛋白質功能性氨基酸［1］，是哺乳動物中樞神經系統中一種重要的抑制性神經遞質［2］。GABA具有多種生理功能，如參與抗心律失常、降血壓［3-4］、改善腦機能、抑制神經遞質［5］、調節心血管［6-7］、增強記憶、鎮靜安神［8］、活化肝腎。自然界中，GABA廣泛存在于動植物和微生物中，但其在動物和植物中含量較低，不容易被提取，因此微生物發酵是目前生產GABA的主要方式。其中產GABA的菌株主要有乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌等。

雖然發酵γ-氨基丁酸所用菌種中最為常見的是大腸桿菌，但大腸桿菌在安全衛生方面存在極大隱患，制約了γ-氨基丁酸的生產和開發。己有研究發現，一些高安全的微生物，如乳酸菌、酵母菌、曲霉等也具有GAD（谷氨酸脫羧酶）活性，可以進行GAD的提取和GABA的生產，但均存在γ-氨基丁酸的產量不高等問題。酵母菌因其安全性較高，并且具有較高的營養價值而被廣泛應用于食品等工業。酵母菌與食品工藝的關系密切，因此篩選高產GABA的酵母菌菌株具有較高的經濟效益［9］。通過誘變的方法選育出高產γ-氨基丁酸的酵母菌株，進行γ-氨基丁酸的發酵生產，具有重要的意義［10］。

本試驗中通過紫外誘變的方法輔助篩選高產γ-氨基丁酸酵母菌產生菌株，確定其最優化發酵條件。以便作為食品添加劑原料或直接應用于生產當中，為工業化生產γ-氨基丁酸提供了基礎條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 新疆石河子張裕蘋果園腐爛蘋果，新疆維吾爾族人自制奶酪，新疆石河子張裕葡萄園葡萄表皮及葡萄園土壤。

1.1.2 培養基

賴氨酸培養基（g/L）：賴氨酸5.6，葡萄糖10.0，KH2PO41.0，MgSO400.5，瓊脂 20.0，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基 （g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，葡萄糖20.0。

γ-氨基丁酸篩選培養基（g/L）：酵母浸粉10.0，蛋白胨20.0，瓊脂20.0，葡萄糖20.0，溴甲酚綠0.001，乙醛酸0.02，琥珀酸0.02。

1.1.3 儀器 Seven Excellence S400型pH計，梅特勒托利儀器（上海）有限公司制造；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠制造；Mini-14K高速離心機，上海昨非實驗室設備有限公司制造；數顯氣浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠制造；Power Cycler Gradient SL PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司制造；IEF-SYS瓊脂糖凝膠電泳儀，英國 Biochrom有限公司制造；LC98I-3A氨基酸分析儀，蘇州華美辰儀器設備有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 樣品經破碎后進行自然發酵，發酵啟動后在整個發酵過程中定期取樣，以不同濃度梯度涂布于賴氨酸培養基，28℃培養48 h，劃線分離；重復多次直至得到單菌落后，接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，28℃培養48 h后，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株篩選 活化菌株按體積分數5%接種量接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基中，28℃，200 r/min搖床培養 48 h后涂布于篩選培養基，28℃培養3 d，觀察菌落顏色，能產生GABA菌株的菌落顯綠色，挑選綠色單菌落保存，備用。

1.2.3 菌株誘變 先開啟紫外燈，預熱20 min以穩定光源。取5 mL不同稀釋度的菌懸液置于6 cm無菌空培養皿中。將培養皿放置于磁力攪拌器上，在18 W的紫外燈下，距離25 cm處，打開皿蓋，在攪拌狀態下分別照射不同時間。各取0.1 mL菌液于試管中，且試管立即放置在冰浴上 l～2 h，低溫條件下細胞內參與突變的各種酶活性受到抑制，使修復難以進行。取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基平板上，每個稀釋度做3個重復，28℃避光培養，3 d后統計菌落總數，取平均值，以未經誘變的平板上的菌落數作為參照，計算致死率。

式 （1）中：D為致死率，Ta為被處理后的活菌數，Tn是未被處理的活菌數。

1）誘變時間的確定：稀釋后的菌液分別紫外照射0、5、10、15、20、25、30 s，取0.1 mL涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基平板上，計算致死率。

2）誘變濃度的確定：取0.1 mL照射后的菌液梯度稀釋，將10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7濃度的菌液0.1 mL用三角玻璃棒涂布于酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基上，然后置于28℃培養箱中保存3 d，計算致死率。

以最佳誘變時間和濃度對產GABA菌株進行誘變，測定誘變前后γ-氨基丁酸質量濃度的變化。

1.2.4 定量定性分析

1）γ-氨基丁酸紙層析定性分析：小燒杯盛有約20 mL展開劑，置于倒置的層析缸中，用塑料薄膜密封，平衡30 min；取層析濾紙一張，在紙的下端距邊緣2 cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2 cm作一記號；用微量注射器分別取2 μL菌懸液和γ-氨基丁酸標液，分別點在標記位置上，吹干后再點2次，用線將濾紙縫成筒狀。將盛有約20 mL展開劑的培養皿迅速置于密閉的層析缸中，將濾紙點樣端朝下直立于培養皿中。待溶劑上升15～20 cm時即取出濾紙，噴茚三酮顯色；用電吹風吹干濾紙，使各層析斑點顯色，觀察試驗結果。

2）定量分析：將篩選出的菌株發酵液離心后去上清液，加三氯乙酸終止反應后，離心取上清液1 mL，用氨基酸自動分析儀精確測定 γ-氨基丁酸質量濃度。

1.2.5 菌株的分子生物學鑒定 采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取試驗菌株DNA，以所得DNA基因組為模板，利用ITS1和ITS4為引物擴增ITS區的基因，PCR反應體系參照文獻［11］，將擴增產物送到北京三博遠志生物技術有限責任公司測序；將ITS序列輸入NCBI（美國國家生物信息中心）的GenBank數據庫進行比對，分析序列同源性，確定該菌株的分類地位。

1.2.6 高產γ-氨基丁酸酵母菌株發酵條件的優化

1）溫度對酵母菌產GABA的影響：分別在培養溫度為20、25、30、35、40、45℃下培養72 h，測定發酵液中GABA含量，確定最佳培養溫度。

2）pH對酵母菌產GABA的影響：分別在pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5下培養72 h，測定發酵液中GABA含量，確定最佳pH值。

3）接種量對酵母產GABA的影響：分別在接種量為體積分數1%、2%、3%、4%、5%，測定發酵液中GABA含量，確定最佳接種量。

4）培養時間對酵母菌產GABA的影響：分別在培養時間為12、24、36、48、60、72 h，測定發酵液中GABA質量濃度，確定最佳培育時間。

5）響應面法優化發酵條件：在單因素試驗結果的基礎上，采用四因素三水平的Box-Behnken響應面試驗設計方法，以pH、溫度、培養時間和接種量為考察因素，以酵母菌產GABA質量濃度為指標進行優化，確定最適培養條件。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

樣品經處理后利用非釀酒酵母菌篩選培養基（賴氨酸培養基），分離出78株非釀酒酵母菌，經篩選培養基及紙層析定性分析，得到4株產γ-氨基丁酸酵母菌株。結果見圖1、圖2。

圖1 產γ-氨基丁酸菌株誘變篩選結果（菌落顏色）Fig.1 Screening results γ-aminobutyric acid producing strain mutation

圖2 γ-氨基丁酸紙層析分析結果Fig.2 Chromatography paper of GABA

2.2 菌株誘變選育

表1 菌株誘變選育對GABA產量的影響Table 1 Effect of mutation on GABA

經紫外誘變處理后A3、Y16、N3、N8四株菌株的GABA含量明顯升高，其中N8菌株含量升高最明顯，由此可見，紫外誘變對于菌株GABA產量的增加有明顯促進作用。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溫度對酵母菌產γ-氨基丁酸的影響 發酵條件為：250 mL的搖瓶裝液量25 mL，接種量體積分數3%，搖床轉速200 r/min，pH 7.0。在此條件下將搖瓶分別放在20、25、30、35、40、45℃5個溫度梯度下培養72 h。測定發酵液中γ-氨基丁酸質量濃度，結果見圖3。

圖3 溫度對GABA產量的影響Fig.3 Influence of temperature in GABA

由圖3可知，隨著培養溫度的增加，GABA質量濃度先增加后降低，培養溫度為35℃時，GABA質量濃度達到最高值3.17 g/L，菌株最佳發酵溫度為35℃。

2.3.2 pH值對酵母產γ-氨基丁酸的影響 發酵條件為：250 mL的搖瓶裝液量25 mL，接種體積分數3%，溫度30℃，搖床轉速200 r/min，調節搖瓶中的起始pH值，分別在pH值4、4.5、5、5.5、6、6.5環境下培養72 h。測定發酵液中γ-氨基丁酸含量，結果見圖4。

圖4 pH值對GABA產量的影響Fig.4 Effect of pH on GABA

由圖4可知，隨著pH的升高，GABA質量濃度先升高后降低［11］，說明pH值的高低對于菌株產GABA有一定影響。在pH為5時，GABA質量濃度達到最高值，菌株最適pH值為5.0。

2.3.3 接種量對酵母產γ-氨基丁酸的影響 在溫度為30℃，250 mL的搖瓶裝液量25 mL，搖床轉速200 r/min，pH 7.0條件下，在搖瓶中加入接種量分別為體積分數1%、2%、3%、4%、5%的菌液，培養72 h后，測定發酵液中γ-氨基丁酸質量濃度。由圖5可知，隨著接種量的增加，GABA質量濃度先增加后降低，接種量達到4%和5%時，GABA質量濃度變化不大，說明接種量超過體積分數4%之后，對于GABA產量影響不大，菌株最適接種量均為體積分數3%。

圖5 接種量對GABA產量的影響Fig.5 Influence of medium volume in GABA

2.3.4 培養時間對酵母產γ-氨基丁酸的影響 在溫度為30℃、250 mL的搖瓶裝液量25 mL、接種量體積分數3%、搖床轉速200 r/min、pH 7.0條件下，分別培養12、24、36、48、60、72 h，測定發酵液中γ-氨基丁酸質量濃度。由圖6可知，隨著發酵時間的延長，發酵液中GABA的產量不斷增加，在48 h前產量增加幅度較大，但48 h后繼續培養則GABA的產量小幅下降。考慮到發酵時間延長，生產的周期也相應延長，勢必增加生產成本，因此實驗確定48 h作為生產GABA的最佳發酵周期［12］。

圖6 培養時間對GABA產量的影響Fig.6 Influence of Incubation time on GABA

2.4 響應面法優化發酵條件

通過測定GABA含量，確定了GABA產量較高的菌株N8，通過單因素試驗確定了試驗菌株的最適溫度為35℃，最適pH值為5，最適接種量為體積分數3%，最適培養時間為48 h。由此確定四因素三水平試驗表，對高產GABA菌株進行四因素三水平響應面試驗，確定最適培養條件。

2.4.1 實驗設計模型方差分析 設計的因素水平編碼見表2。按照試驗設計每個組合重復試驗3次，GABA產量結果取其平均值，采用Design-Expert 8.0.0軟件分析試驗結果。由表3回歸模型方差分析結果可以看出，實驗設計模型P＜0.000 1，極度顯著，表明試驗設計可靠；失擬項P=0.544 1＞0.05，不顯著，表明所建立的二次回歸模型成立，試驗點均能用模型描述。

表2 GABA產量Box-Behnken設計因素及水平編碼Table 2 Coding and the level of GABA content in Box-Behnken design factors

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數的顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance for the established regression model and significance test of each regress ion coefficient

根據表3回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，A、C、D、A2、B2、C2、D2對GABA產量的影響極顯著，AB、AD、BD對GABA產量的影響顯著，B、AC、BC、CD對GABA產量的影響不顯著。GABA產量影響因素依次為D＞C＞A＞B，即接種量＞培養時間＞溫度＞pH。

2.4.2 響應面圖形分析 由圖7溫度與pH值的交互作用可以看出，溫度為34℃時，隨著pH的升高GABA的含量先增加后降低，溫度為34℃，pH為5.0時GABA產量達到最高點，此時GABA質量濃度達到4.25 g/L。

圖7 溫度和pH兩因素及其交互作用響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

由圖8溫度與接種量的交互作用可以看出，溫度為34℃時，隨著接種量的增加GABA的產量先增加后降低，但是下降幅度不大；溫度為34℃，接種量為體積分數3%時GABA產量達到最高點，此時GABA質量濃度達到4.25 g/L。

由圖9 pH與接種量的交互作用可以看出，pH為5.0時，隨著接種量的增加GABA的產量先增加后降低，接種量從體積分數2%到3%上升幅度較大，pH為5.0，接種量為體積分數3%時GABA產量達到最高點，此時GABA質量濃度達到4.25 g/L。

圖8 溫度和接種量兩因素及其交互作用響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

圖9 pH值與接種量兩因素及其交互作用響應面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots showing the effects of three process parameters on the extraction rate of safflower seed meal protein

2.4.3 模型驗證試驗 根據模型的響應面圖和等高線圖可以直觀地分析出各自變量之間的關系及顯著性，模型分析最佳條件為培養溫度 33.95℃，pH值5.01，培養時間 49.17 h，接種量為體積分數3.17%。將N8菌株分別接入經過優化后的最佳條件培養基中，采用比色法測定GABA產量。優化后的GABA產量為 4.926 g/L，試驗值與模型計算值相差+2%，模型對實際發酵的情況可以較好地預測，證明響應面分析法對發酵條件的優化是可行有效的。

3 討論

目前國內外對于乳酸菌產γ-氨基丁酸的研究較多，但對于酵母菌的研究較少，誘變選育研究則更是少。通過初篩、復篩及誘變挑選出高產γ-氨基丁酸的菌株，其中最佳誘變劑量為：最佳誘變時間為30 s，誘變濃度為10-5。經過多次篩選測定菌株γ-氨基丁酸含量，篩選出高產γ-氨基丁酸菌株N8（Hanseniaspora.sp），其γ-氨基丁酸質量濃度高達4.55 g/L，比誘變前產量提高了2.3倍，說明本次試驗方法有效。通過單因素和四因素三水平響應面試驗優化菌株最適發酵條件，利用Design-Expert軟件對Box-Behnken設計的實驗結果進行回歸擬合，得到理論結果：培養溫度 33.95℃，pH值5.01，培養時間 49.17 h，接種量為體積分數3.17%，優化后的γ-氨基丁酸質量濃度也達到了4.926 g/L，與預測值相差不大，表明優化條件符合要求。比胡超［10］等報道的酵母產GABA量2.588 g/L提高很多。

4 結語

酵母菌是重要的微生物資源［11］，在釀造、食品、醫藥等工業占有重要的地位。各種以酵母為原料或載體的食品和添加劑都得到了很好的推廣，其中既有酵母本身的有利條件，也說明了社會對酵母菌這種微生物的認可［12］。隨著GABA的生理功能研究不斷深入，對GABA的研究開發已經成為新的熱點。利用微生物自然資源，分離篩選新功能的酵母菌，生產GABA功能性食品配料，是一種新的嘗試，也有利于微生物資源的開發和利用［13］。在現今社會，人們對日常的保健和飲食的要求越來越高，必將導致保健食品消費的熱潮，因此高產GABA的酵母菌株的開發應用將有良好的前景［14］。

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科技信息

美國規定2016年6月起嬰兒奶粉須含硒

美國食品及藥物管理局（FDA）于2015年6月通過一項最終規則，修訂關于嬰兒配方奶粉營養規格及標簽的規例，要求必須把硒加入所需營養清單，并訂立嬰兒配方奶粉最低及最高的硒含量。該項最終規則的生效日期已確定為2016年6月22日。《美國食品、藥品及化妝品法》規定嬰兒配方奶粉必須含有29種指定營養，并為各種營養訂立最低含量水平，也為其中9種營養訂立最高含量水平。FDA最初為嬰兒配方奶粉訂立營養規格時，未有把硒列為必要營養。其后，硒被認定為一種必要營養，遂于今年6月決定把硒列入所需營養清單，并規定嬰兒配方奶粉須標明每100千卡的硒含量。同時要求嬰兒配方奶粉的最低及最高硒含量分別為2.0微克/100千卡和7.0微克/100千卡。

［信息來源］國家質量監督檢驗檢疫總局.美國規定2016年6月起嬰兒奶粉須含硒 ［EB/OL］.（2016-6-22）.http:// www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/tzdt/gzdt/201606/t20160622_468802.htm

Screening，Identification and Optimizing of γ-Aminobutyric Acid Production in Yeast

XIAO Jing1，XU Yanan2，LI Qi2，ZHANG Yanwei2，LIU Yan2，SHI Xuewei*2

（1.College of Information Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A strain with capability of producing γ-aminobutyric acid was isolated from the traditional food in Xinjiang and the fermentation conditions were optimized.Non-Saccharomyce yeast were isolated and further used to screen the strain with high yield of γ-aminobutyric acid.The isolated strain was identified as Hanseniaspora uvarum XYN019 by morphology and phylogenetic analysis based on the 26S rRNA sequence.The activity of amino acid production was 2.3 times higher as compared with the original one by UV mutagenesis.The optimum mutagenesis conditions are with 30s irradiation and 10-5concentration.The better transformation conditions as follows：initial pH 5.01，culture temperature 33.95℃，inoculum size 3.17%and culture time 49.17 h.In this condition，the yielding capacity of GABA by the mutant was 4.926 g/L.These results suggested that the strain can be used to produceγ-aminobutyric acid and has a higher converting capability of GABA.

γ-aminobutyric acid，screening，identification，non-Saccharomyce

TQ 925.6

A

1673—1689（2016）08—1093—07

2015-03-03

新疆生產建設兵團科技攻關項目（P20136500002-1146，2015AB016，2016AB009）；新疆生產建設兵團青年科技創新資金項目（DEC_PGUEIK_893341）；新疆生產建設兵團科技攻關與成果轉化計劃項目（2016AD024）。

肖 婧（1982—），女，甘肅會寧人，工學碩士，講師，主要從事生物信息學研究。E-mail：463091503@qq.com

*通信作者：史學偉（1980—），男，甘肅會寧人，工學博士，副教授，主要從事酵母菌種遺傳研究。E-mail：1549730027@qq.com