產β-葡萄糖苷酶酵母菌的分離鑒定及酶學特性

徐亞男，史學偉， 安洋洋， 談思維，肖 婧，童軍茂*

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000；2.包頭職業技術學院 經管系，內蒙古 包頭010043）

產β-葡萄糖苷酶酵母菌的分離鑒定及酶學特性

徐亞男1，史學偉1， 安洋洋2， 談思維1，肖 婧1，童軍茂*1

（1.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000；2.包頭職業技術學院 經管系，內蒙古 包頭010043）

在葡萄酒自然發酵的初期，非釀酒酵母菌占主導地位，其產生的β-葡萄糖苷酶獨特的水解活性，能夠賦予葡萄酒特殊的香氣。在新疆赤霞珠葡萄酒發酵過程中，通過對非釀酒酵母菌的采集與篩選，得到1株產β-葡萄糖苷酶能力較強的菌株；紫外-微波復合誘變后，酶活力增加1.81倍；經26S rRNA基因序列分析，鑒定為克魯維畢赤酵母，并命名為XYN086（P.kluyveri XYN086）；酶學性質研究表明：該菌株所產β-葡萄糖苷酶最適pH為6.0，在pH 6.0～8.0時酶活力保持60%以上；酶的最適作用溫度為60℃，在60℃酶活力保持較好；金屬離子依賴性實驗表明，Fe2+和Cu2+對該菌株所產β-葡萄糖苷酶的酶活力均有激活作用，Mg2+、Ca2+、K+和Na+均有抑制作用，說明此菌株所產的β-葡萄糖苷酶對金屬離子具有依賴性。據以上數據確認，該菌株為產β-葡萄糖苷酶克魯維畢赤酵母。

β-葡萄糖苷酶；非釀酒酵母菌；酶學特性

β-葡萄糖苷酶在生物能源、食品工業、保健品、農業、醫藥等領域有著廣泛的應用。β-葡萄糖苷酶屬纖維素酶類，在生物能源領域，纖維素發酵生產燃料乙醇等過程中，添加一定的β-葡萄糖苷酶或產β-葡萄糖苷酶菌株，可提高纖維素降解的酶反應速率，為生物能源的利用與開發奠定了基礎；在食品工業領域，β-葡萄糖苷酶作用于水果中的芳香前體物質，利于果汁脫苦和果汁增香，并可用作食品添加劑；在保健品行業中，β-葡萄糖苷酶應用于大豆異黃酮等，可有效增加產量和降低生產成本，其工業化應用前景較高；在農業領域，生氰β-葡萄糖苷酶在植物病蟲害的綠色防治上具有重大意義；在醫藥領域，β-葡萄糖苷酶可應用于某些疾病的診斷和治療。

非釀酒酵母菌是一類自然存在于葡萄表皮、釀酒環境中，能分泌多種胞外酶，通過代謝和自溶提高發酵食品的感官特性，參與復雜新鮮的風味物質形成的酵母菌［1］。葡萄酒的主要香氣成分取決于葡萄中揮發性次級代謝產物的數量和化學性質［2］。其中，以自由分子或非芳香糖基化前體物質存在的烷烴貢獻最大［3］。β-葡萄糖苷酶能夠顯著增加葡萄酒中非芳香糖基化前體物質的水解和芳香物質的釋放［4］，在葡萄酒的香氣形成過程中起重要作用。在葡萄酒自然發酵過程的初期，非釀酒酵母菌占主導地位，其產生的β-葡萄糖苷酶獨特的水解活性，能夠賦予葡萄酒特殊的香氣［5-6］。但是，目前已知菌株產β-葡萄糖苷酶的酶活力普遍比較低，在一定程度上限制了β-葡萄糖苷酶的工業化生產。因此，直接從自然界中篩選出產β-葡萄糖苷酶且酶活較高的菌株是最直接并且最有效的方法。

在新疆赤霞珠葡萄酒發酵過程中，經鑒別培養基采集非釀酒酵母菌，得到一株能分泌β-葡萄糖苷酶的野生菌株，通過分子生物學鑒定為克魯維畢赤酵母；并對其酶學特性進行初步研究，證實其在食品工業領域有著良好的應用前景，進一步應用于新疆特色釀造發酵行業中，以期改善產品質量，提高設備利用率，同時為后期的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗葡萄 赤霞珠葡萄，采自新疆葡萄園。

1.1.2 培養基 酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（g/dL）：葡萄糖2.0，酵母提取物 2.0，蛋白胨2.0；pH 7.0，121℃滅菌20 min。賴氨酸培養基［7］（g/dL）：賴氨酸0.56，葡萄糖1.0，KH2PO40.1，MgSO40.05，瓊脂2.0；121℃滅菌20 min。篩選培養基（g/dL）：葡萄糖2.0，蛋白胨2.0，酵母浸粉1.0，p-NPG 1.0；自然pH值，121℃滅菌20 min。發酵培養基（g/dL）：葡萄糖 2.0，蛋白胨 2.0，酵母浸粉 1.0，NH4NO30.3，KH2PO40.4；自然pH值，121℃滅菌20 min，在溫度降到60～70℃左右加入0.1 g/dL p-NPG。

1.1.3 儀器 Seven Excellence S400型pH計，梅特勒托利儀器（上海）有限公司制造；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠制造；Mini-14K高速離心機，上海昨非實驗室設備有限公司制造；數顯氣浴恒溫振蕩器，金壇市精達儀器制造廠制造；7200型可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司制造；Power Cycler Gradient SL PCR儀，德國耶拿分析儀器股份公司制造；IEFSYS瓊脂糖凝膠電泳儀，英國Biochrom有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 葡萄樣品經破碎后帶皮進行自然發酵，發酵啟動后在整個發酵過程中定期取樣，以不同濃度梯度涂布于賴氨酸培養基，28℃培養48 h，劃線分離；重復多次直至得到單菌落后，接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，28℃培養48 h后，保存于-80℃冰箱。

1.2.2 產酶菌株的篩選 取試驗菌株的菌懸液0.1 mL，以10倍系列稀釋至10-1～10-6，分別取各個梯度稀釋液1 mL接種于篩選培養基上，培養72 h后，噴1 mol/L碳酸鈉，選擇其中顯示黃色光圈的菌株作為初篩菌株；初篩菌株接種于發酵培養基，置于溫度30℃的搖床，150 r/min培養72 h后，發酵液于8 000 r/min離心10 min，除菌，收集上清液，于紫外分光光度計400 nm下測定吸光值；篩選酶活力大的菌株，備用。

1.2.3 產酶菌株誘變選育 將篩選出的菌株發酵液在離心機中5 000 r/min離心8 min，棄去上清液，用無菌水重新懸浮；吸取2 mL放置于4℃冰箱中作為對照；剩余的菌液，吸取5 mL加入無菌平板中，平板置于紫外燈已照射30 min的磁力攪拌器上，等距離放置距燈30 cm處，照射20 min，得誘變菌株1；誘變菌株1放入微波源為2 450 MHz、850 W的微波爐中，每照射10 s，冷卻10 s后再照射10 s，冷卻后在37℃培養60 h，得到最終誘變菌株。

1.2.4 粗酶液的提取和 β-葡萄糖苷酶活性測定

取誘變菌株和對照菌株發酵液于4℃8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。取0.05 mL酶液，將50 mL 0.2 g/dL p-NPG溶液，0.15 mL pH值為5.0的醋酸緩沖液混合后，30℃下水浴預熱10 min后立即加入碳酸鈉中止反應。室溫放置5 min，400 nm處測吸光值，同時做空白樣品；酶活力單位（IU）定義：每分鐘生成1 μmol對硝基苯酚用酶量為1個酶活單位。酶活力計算公式：

式中：X為酶活力 （IU/mL）；A為吸光值；K為吸光常數；V為反應總體積；n為稀釋倍數；t為反應時間。

1.2.5 菌株的分子生物學鑒定 采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取試驗菌株DNA，以所得基因組DNA為模板，利用ITS1和ITS4為引物擴增ITS區的基因，PCR反應體系參照文獻［8］，將擴增產物送到北京三博遠志生物技術有限責任公司進行測序；將ITS序列輸入NCBI（美國國家生物信息中心）的GenBank數據庫中進行比對，分析序列同源性，確定該菌株的分類地位。

1.2.6 粗酶性質研究

1）pH對酶活的影響：分別配制pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的檸檬酸緩沖溶液，測定酶活力，以最高點酶活為100%，其他與之相比得相對酶活，繪制酶最適pH值曲線；

2）pH穩定性研究：粗酶液分別與等量不同pH緩沖液混勻，置于30℃下水浴保溫1 h后，測定剩余酶活，以最高點酶活為100%，其他pH條件下與之相比為相對酶活，繪制酶的pH值穩定性曲線；

3）溫度對酶活的影響：在溫度分別為30、40、50、60、70℃下測酶活，以最高點酶活為100%，其他與之相比得相對酶活，以確定最適反應溫度，繪制酶催化溫度曲線；

4）熱穩定性研究：粗酶液置于50、60、70℃不同溫度下保溫一定時間，取出后迅速冷卻，以pH為7.0 2 g/dL葡萄糖溶液為底物溶液，在30℃下測定剩余酶活，以未經處理的酶溶液酶活為100%，其他溫度條件下與之相比為相對酶活，繪制酶熱穩定性曲線；

5）金屬離子對酶活的影響：反應體系中加1 mL終濃度為 1 mmol/L的各種金屬離子 Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Na+、K+，充分混勻后在30℃下放置24 h，測酶活，以1 mL雙蒸水代替金屬離子的酶溶液酶活力為100%，其他金屬離子與之相比為相對酶活。

1.2.7 數據分析 獨立重復進行3次試驗，結果是3次測定的平均值±標準偏差，所有曲線以Origin 8作圖。

2 結果與討論

2.1 產酶菌株的篩選

以采集于發酵過程中的新鮮葡萄汁為分離源，分離得到具有水解β-葡萄糖苷酶活性的菌株3株，通過β-葡萄糖苷酶黃色光圈亮度試驗，得到黃色光圈較明顯的1號和2號菌株，結果如表1所示。

表1 產酶菌株篩選結果Table 1 Results of the screening strain

由表1可知，分離得到的3株菌株均產β-葡萄糖苷酶，通過黃色光圈亮度可知，1號和2號菌株水解能力最強，3號菌株次之；酶活測定結果表明，1號菌株產β-葡萄糖苷酶能力高于其他2株，2號菌株酶活力高于3號菌株，表明1號和2號菌株均具有可能的開發前景，故選擇1號和2號菌株為本次試驗初次篩選的菌株。

2.2 產酶菌株誘變選育

將產β-葡萄糖苷酶能力較好的菌株進行誘變選育，結果見表2。可知，各菌株經紫外-微波復合誘變后，酶活力均不同程度增大，1號菌株酶活力增加（13.12±1.45）IU/mL，2號菌株酶活力增加（5.05±0.29）IU/mL，經誘變后，1號菌株所產β-葡萄糖苷酶活力明顯高于2號菌株，故本次試驗所得菌株為1號誘變菌株。

表2 菌株誘變選育對酶活的影響Table 2 Effect of mutation on β-glucosidase activity

2.3 26s rRNA基因序列分析

對1號菌株進行DNA的提取和PCR擴增，通過分子生物學手段鑒定該菌株的ITS核苷酸序列如下：

GTCGCTACTACCGATTGAATGGCTTAGTGAGG CTCCAAGATTGGCGCCGCGGGAGGGGCAACTTTC CCATGGCGCTGAAAATTCAGTCAAACTTGGTCATT TAGAGGTCGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTA GGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGTGATTTAT ATCTTATACACATGCGTGAGCGCACCAAACACCTA AAATTGTAATACCACAGTCACTAAGTTTTAACAAA ACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC ATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAG TGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCATCGAGTTCTT GAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGG CATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGCAA GCAGAGTTGAGAACAGGCTATGCCTTTTTCGAAAT GGAACGTCGTGGACGAAGTGAACTAAACTTTTAG CACGCTTTGGCCGCCGAACTTTTAACTAAGCTCGA CCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACA GGGATTGCCTCAGTAGCGGCGAGTGAAGCGGCAA GAGCTCAGATTTGAAATCTCACCTAGTGTGCGAG

見表 3，1號菌株的 26s rRNA基因序列和BLAST比對結果顯示，它與Pichia kluyveri strain 28FR菌的26s rRNA（KJ095611）有100%的相似度。構建的系統發育樹 （圖1）表明，1號菌株在Pichia屬進化樹一個分支上。因此，該菌株為克魯維畢赤酵母，命名為XYN086（P.kluyveri XYN086）。

表3 1號菌株的26s rRNA基因測序BLAST結果Table 3 BLAST results of 26s r RNA gene sequencing of strain 1

圖1 1號菌株（XYN086）基于26s r RNA基因發育樹Fig.1 Development tree diagram based on 26s r RNAgenes of strain 1（XYN086）

2.4 酶的最適pH及其酸堿穩定性

測定不同pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響，如圖2所示，隨著pH的增加，該菌株所產β-葡萄糖苷酶酶活力逐漸增大，在pH 6.0時達到最高，pH繼續增加，酶活力降低較大幅度，故確定該菌株的產酶最適pH為6.0。

如圖3所示，該菌株所產β-葡萄糖苷酶在pH為6.0時，酶活力保持最佳，在pH 6.0～8.0，可保持較好酶活力 （相對酶活大于60%），在強酸pH為3.0、強堿pH為10.0時，酶活損失較嚴重，損失率約為80%。說明該菌株所產β-葡萄糖苷酶在pH 6.0～8.0較穩定，利于β-葡萄糖苷酶的貯藏和生產。

圖2 pH對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on β-glucosidase activity

圖3 pH穩定性Fig.3 pH stability

2.5 酶的最適溫度及其熱穩定性

在不同溫度下，測定β-葡萄糖苷酶的活性，由圖4可知，隨著溫度的增加，β-葡萄糖苷酶活力增大，在60℃時，該菌株表現了最佳酶活力，在50～60℃各菌株均具有較高活性，當溫度低于30℃或高于70℃時，酶活力顯著降低。

圖4 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.4 Effects of temperature on β-glucosidase activity

如圖5所示，隨著溫度的升高，經一段時間后，酶的活性逐漸降低；在60℃下，在不同時間內，測定的酶的活性相對穩定，保溫60 min后，仍保留80%的活性；70℃下保溫20 min后，酶活力損失30%，保溫60 min后，剩余酶活力僅為21%。由此可知，該β-葡萄糖苷酶在60℃即最適溫度下擁有良好的穩定性。

2.6 金屬離子對蛋白酶活性的影響

如表4所示，Fe2+和Cu2+對該菌株所產β-葡萄糖苷酶的酶活力均有激活作用，Fe2+的激活作用不明顯，Cu2+的激活作用最強，為 （136.92±2.27）%；Mg2+、Ca2+、K+和Na+對該菌株所產β-葡萄糖苷酶的酶活力均有抑制作用，K+的抑制作用最顯著，為（43.51±1.21）%，說明該菌株所產的β-葡萄糖苷酶需要依賴金屬離子維持其活性。

圖5 熱穩定性Fig.5 Thermal stability

表4 金屬離子對酶活力的影響Table 4 Effects of metal ions on β-glucosidase activity

3 結語

在新疆赤霞珠葡萄酒發酵過程中，通過對非釀酒酵母菌的采集與篩選，得到1株產β-葡萄糖苷酶能力較強的菌株；紫外-微波復合誘變后，酶活力增加1.81倍；經26s rRNA基因序列分析，鑒定為克魯維畢赤酵母，并命名為 XYN086（P.kluyveri XYN086）；酶學性質研究表明：該菌株所產β-葡萄糖苷酶最適pH為6.0，在pH為6.0～8.0時酶活力保持在60%以上；酶的最適作用溫度為60℃，在60℃酶活力保持較好；金屬離子依賴性發現，Fe2+和Cu2+對該菌株所產β-葡萄糖苷酶的酶活力均有激活作用，Cu2+的激活作用最強，為 （136.92±2.27）%；Mg2+、Ca2+、K+和Na+均有抑制作用，K+的抑制作用最顯著，為（43.51±1.21）%，說明此菌株所產的β-葡萄糖苷酶對金屬離子具有依賴性。據以上數據確認，該菌株為產β-葡萄糖苷酶克魯維畢赤酵母。

參考文獻：

［1］SEGURA-García L E，TAILLANDIER P，BRANDAM C，et al.Fermentative capacity of Saccharomyces and non-Saccharomyces in agave juice and semi-synthetic medium［J］.LWT-Food Science and Technology，2015，60（1）：284-291.

［2］van Rensburg S J，BERMAN P A，POTOCNIK F C V，et al.Glycosylation of transferrin in Alzheimers disease and alcohol-induced dementia［J］.Metabolic Brain Disease，2010，15（4）：243-247.

［3］MARAI L，KUKSIS A.Simultaneous quantitation of krebs cycle and related acids by mass fragmentography［J］.Journal of Chromatography（A），2013，268：447-460.

［4］RAPP A，MANDERY H.Wine aroma［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2000（8）：873-884.

［5］LAFFORT P，ETCHETO M，PATTE F.Implications of power law exponent in synergy and inhibition of olfactory mixtures［J］. Chemical Senses，2011，14（1）：11-23.

［6］MULLER C J，FUGELSANG K C.Red wine but not white：the importance of fully characterizing wines used in health studies［J］. The American Journal of Clinical Nutrition，2000，66（2）：447.

［7］FERNANDEZ R M，LAMY-FREUND M T.Correlation between the effects of a cationic peptide on the hydration and fluidity of anionic lipid bilayers：a comparative study with sodium ions and cholesterol［J］.Biophysical Chemistry，2000，87（2）：87-102.

［8］MANZANARES P，ROJAS V.A preliminary search for anthocyanin-beta-D-glucosidase activity in non-Saccharomyces wine yeasts［J］.International Journal of Food Science and Technology，2000，35（1）：95.

科技信息

韓國修訂糖、碳水化合物、脂肪、維生素D、鉻等的每日營養成分標準值

2016年6月16日，據韓媒報道，韓國食品和藥品安全部于15日發布了《食品等的標示標準》部分修改告示（案）行政預告。

糖類的每日營養成分標準值規定為100 g，并對碳水化合物、脂肪、維生素D、鉻等的標準值進行了調整。碳水化合物由330 g下調至324 g，脂肪由51 g上調至54 g，維生素D由5 μg上調至10 μg，鉻由50 μg減至30 μg。

另外，為使以嬰幼兒、孕婦、哺乳期婦女等特定人群為對象的食品可以該類人群的推薦攝入量或充分攝入量為標準進行標示，對 “韓國人營養素攝取標準表”進行修改。

根據糖類標準值的制定，對于糖類，要標示營養成分標準值相關比例，營養標示表格圖案中追加糖類的“1日營養成分標準值相關比例（%）”。

［信息來源］WTO檢驗檢疫信息網.韓國修訂糖、碳水化合物、脂肪、維生素D、鉻等的每日營養成分標準值 ［EB/OL］.（2016-6-17）.http://www.wtociq.gov.cn

Isolation，Identification and Enzymatic Characteristics of Yeasts Producing β-Glucosidase

XU Yanan1，SHI Xuewei1，AN Yangyang2，TAN Siwei1，XIAO Jing1，TONG Junmao1
（1.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Administered by the Department，Baotou Vocational and Technical College，Baotou 010043，China）

During the fermentation of wine under natural conditions，non-Saccharomyces yeasts predominate in the initial stage of fermentation，and they can produce the unique hydrolytic activity β-glucosidases which give the wine a special aroma.In this study，a strain with good capacity of producing β-glucosidase was isolated from mustby the collection and screening of non-Saccharomyces yeasts during the fermentation of Xinjiang Cabernet.The strain was indentified as Pichia kluyver and named P.kluyveri XYN086 by morphology and ITS sequence analysis.The studies on enzymatic properties showed that the optimum pH for the β-glucosidase was 6.0 and its activity remained at more than 60%in pH 6.0-8.0.Furthermore，the optimum temperature for this enzyme was 60℃ and its activity was kept better at this temperature.Metal ions has a great influence on the activity of β-glucosidase，the enzyme was activated by Fe2+and Cu2+，whereas it was inhibited by Mg2+，Ca2+，K+，and Na+.These results showed that XYN086 had the potentialdevelopment values of producing β-glucosidase.

β-glucosidase，non-Saccharomyces，enzymatic characteristics

Q 939.9

A

1673—1689（2016）010—1100—06

2015-01-07

新疆生產建設兵團科技攻關項目（P20136500002-1146；2015AB016，2016AB009）；新疆生產建設兵團青年科技創新資金項目（DEC_PGUEIK_893341）；新疆生產建設兵團科技攻關與成果轉化項目（2016AD024）。

*通信作者：童軍茂（1963—），男，山東招遠人，工學博士，教授，主要從事果蔬貯藏與加工研究。E-mail：1730233122@qq.com