注射用頭孢曲松鈉動物體內藥代動力學和相對生物利用度研究

臧衛軍+高穎慧+向志雄+張樂多

摘 要 目的：對比上海新亞藥業與羅氏制藥生產的兩種注射用頭孢曲松鈉產品（簡稱為新亞和羅氏芬）在SD大鼠和食蟹猴的藥代動力學性質差異。方法：實驗動物在靜脈注射和肌肉注射后，采用UPLC-MS/MS測定血漿中頭孢曲松濃度，通過Kinetica 5.1計算藥代動力學參數。結果：靜脈注射后，新亞和羅氏芬在SD大鼠體內的AUC0-t分別為483.4±179.5 μg·h/ml、542.4±166.0 μg·h/ml、在食蟹猴體內分別為1 703.6±564.4 μg·h/ml、1 811.7±601.7 μg·h/ml。肌肉注射后，新亞和羅氏芬在SD大鼠體內的AUC0-t分別為412.6±153.4 μg·h/ml、451.7±147.1 μg·h/ml、在食蟹猴體內分別為1 454.9±592.9 μg·h/ml、1 367.3±772.0 μg·h/ml。相對于羅氏芬，新亞在SD大鼠體內靜脈和肌肉注射的相對生物利用度分別為（89.1±98.6）%、（91.3±55.4）%、在食蟹猴體內分別為（94.0±9.6）%、（106.4±103.0）%。結論：兩種制劑在大鼠和食蟹猴上的藥代動力學特點類似，未見顯著差異。

關鍵詞 注射用頭孢曲松鈉 藥代動力學 相對生物利用度

中圖分類號：R978.11； R969.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2016）21-0070-06

Study on the pharmacokinetics of ceftriaxone sodium for injection and its relative bioavailability in SD rat and cynomolgus monkey

ZANG Weijun*， GAO Yinghui， XIANG Zhixiong， ZHANG Leduo（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To compare pharmacokinetic properties of two kinds of ceftriaxone sodium which were produced by Shanghai New Asia pharmaceutical and Roche pharmaceuticals （New Asia and Rocephin for short）. Methods： SD rats and cynomolgus monkeys were intravenously or intramuscularly injected with one of the two preparations， respectively. Their concentrations in plasma were determined by UPLC-MS/MS. The pharmacokinetic parameters were calculated by Kinetica 5.1. Results： The areas under the curve （AUC0-t） of New Asia and Rocephin were 483.4±179.5 and 542.4±166.0 μg·h/ml in SD rats and 1 703.6±564.4 and 1 811.7±601.7μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intravenous injection and 412.6±153.4 and 451.7±147.1 μg·h/ml in SD rats and 1 454.9±592.9 and 1 367.3±772.0 μg·h/ml in cynomolgus monkeys via intramuscular injection， respectively. The relative bioavailability of New Asia was（89.1±98.6）% and （94.0±9.6）% in SD rat and cynomolgus monkeys via intravenous injection and （91.3±55.4）% and （106.4±103.0）% in SD rat and cynomolgus monkeys via intramuscular injection， respectively. Conclusion： The pharmacokinetic properties of both preparations in SD rats and cynomolgus monkeys are similar and the significant differences are not found.

KEY WORDS ceftriaxone sodium for injection； pharmacokinetic； relative bioavailability

注射用頭孢曲松鈉屬于頭孢第三代廣譜抗生素，具有廣譜、高效、長效及不良反應少等特點，臨床常用于控制格蘭陰性菌引起的感染[1]。目前國內外有眾多企業生產該產品，上海新亞藥業為其中之一。本文研發了一種應用UPLC-MS/MS檢測頭孢曲松鈉的方法，它具有高靈敏度、高選擇性的特點。運用此方法研究了上海新亞藥業產品（簡稱新亞）和原研企業羅氏制藥產品（羅氏芬）在大鼠和食蟹猴體內的藥代動力學特性，并進行等效性分析[2-3]，以期為新亞產品的臨床應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器

API 4000 QTRAP 型串聯質譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Waters Acquity UPLC系統，包括二元輸液泵，自動進樣器，（美國Waters公司）；Valco 2-Position 型切換閥（美國Valco Instruments公司）。Thermo-X3R離心機（德國Thermo公司）、Eppendorf 熱封儀（美國Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

大鼠藥代動力學注射用頭孢曲松鈉藥品（上海新亞藥業，批號1411128）；原研藥羅氏芬（上海羅氏制藥有限公司，批號SH1793）。食蟹猴藥代動力學注射用頭孢曲松鈉藥品（上海新亞藥業，批號1509138）；原研藥羅氏芬（上海羅氏制藥有限公司，批號SH1800）。頭孢曲松鈉標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號130480-200903，含量83.7%）。內標：替硝唑（上海醫藥合成研究室提供）；甲醇（Merck KGaA，色譜純）；肝素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號20131017）；醋酸銨（德國CNW，色譜純）；去離子水（由Milli-Q純水儀制備）。

1.3 實驗動物

SD大鼠：24只，雌雄各半，180～200 g，生產許可證號：BK-SCXK（滬）2013-0016，動物合格證號：2008001655333。來源：上海西普爾必凱實驗動物有限公司。

食蟹猴：12只，雄性，2～4 kg，生產許可證號：SCXK桂2011-0002，動物合格證號：0002849。來源：廣西雄森靈長類實驗動物養殖開發有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 溶液配制

1）標準品儲備液 精密稱取24.75 mg頭孢曲松鈉標準品，置于1 ml離心管中，加水定容至414 μl，配制成濃度為50 mg/ml的標準品儲備液。

2）標準曲線用溶液 取50 mg/ml標準品儲備液，用水依次稀釋儲備液配制成15 000、13 500、5 000、1 500、500、150、50、10、5 μg/ml的系列標準溶液1。取標準系列溶液1各10 μl，加入到190 μl空白血漿中，配制成750，675，250，75，25，7.5，2.5，0.5，0.25 μg/ml的標準曲線樣品[4-7]。

3）質控血漿樣品 精密稱取頭孢曲松鈉標準品21.94 mg，置于1 ml離心管中，加水定容至367 μl，配制成濃度為50 mg/ml的質控標準品儲備液。先用水稀釋成12 000、2 250、5 μg/ml的3個溶液，然后各取10 μl加入到190μl空白血漿中，配制成600、112.5、0.25 μg/ml的高、中、低濃度質控血漿樣品。

1.4.2 給藥劑量和方法

參照羅氏芬產品說明書，將新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉分別配制成：①SD大鼠靜脈注射用藥液10 mg/ml，給藥劑量為100 mg/kg、體積為10 ml/kg；②SD大鼠肌肉注射用藥液20 mg/ml，給藥劑量為100 mg/kg、體積為5 ml/kg；③食蟹猴靜脈注射用藥液25mg/ml，給藥劑量為50 mg/kg、體積為2 ml/kg；④食蟹猴肌肉注射用藥液50 mg/ml，給藥劑量為50 mg/kg、體積為1 ml/kg。

1.4.3 實驗方案

SD大鼠24只雌雄各半，分為4組，分別為羅氏芬和新亞靜脈注射組和肌肉注射組，每組3雌3雄。在給藥前，所有動物禁食過夜（10～18 h），給藥后4 h給食。分別于給藥前和給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h于大鼠眼底靜脈叢取血0.4 ml。

健康雄性食蟹猴12只，采用交叉設計，分別靜脈或肌肉注射新亞產品及羅氏芬，間隔1周后給藥。受試動物在試驗日前3～7 d應在試驗場所進行適應性飼養。在給藥前，所有動物禁食過夜（10～18 h），給藥后4 h給食。給藥后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h經股靜脈采集血樣1.0 ml。

血樣采集后加入5 mg/ml肝素鈉10 μl抗凝，放置冰上，于4 ℃、4 300×g離心5 min，取血漿至離心管中于-20 ℃保存備用。

1.4.4 血漿樣品處理

取血漿樣品50 μl，加入200 μl含內標（10 ng/ml替硝唑）的甲醇溶液沉淀蛋白。渦旋10 min，6 000×g離心10 min，取上清用起始流動相稀釋10倍后于96孔板中進樣分析。

1.4.5 樣品測定方法

色譜條件：BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm，美國Waters公司）；流動相A為2 mmol/L醋酸銨水溶液，流動相B為甲醇溶液，梯度洗脫程序如下：0→0.5 min 流動相A和B 的比例為95∶5，0.5→1.0 min線性變至5∶95，1.0→2.2 min 維持5∶95，2.2→2.5 min 線性恢復至95∶5，2.5→3 min 保持95∶5。流速0.35 ml/min，進樣器溫度4 ℃，柱溫40 ℃，進樣量5 μl。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源（Turbo Ionspray，ESI）；源噴射電壓為5 500 V；溫度為500 ℃；離子源氣體1（N2）壓力為50 psi；離子源氣體2（N2）壓力為50 psi；氣簾氣體（N2）壓力為20 psi；碰撞氣壓力（CAD）為Medium；掃描時間為100 ms；正離子方式檢測；掃描方式為多反應監測（MRM），監測離子對m/z 555.2→m/z 396.2（頭孢曲松鈉），m/z 248.1→m/z 121.0（替硝唑）；頭孢曲松鈉和替硝唑的去簇電壓（DP）分別為60 V和85 V；碰撞能量（CE）分別為19 V和23 V[8-10]。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 方法的專屬性

分別取6只大鼠和食蟹猴的空白血漿，除不加內標外，按1.4.4項下方法處理并分析，得到空白樣品的色譜圖；將一定量的頭孢曲松鈉標準溶液和內標溶液加入上述大鼠和食蟹猴空白血漿中，依同法操作，獲得相應的色譜圖；同樣方法得到大鼠和食蟹猴給藥后4 h樣品色譜圖（圖1）。結果表明，大鼠和食蟹猴血漿樣品中內源性物質不干擾頭孢曲松鈉及內標的測定。

2.1.2 線性關系

以待測物濃度為橫坐標X （ng/ml），待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標Y，用加權（W =1/X2）最小二乘法進行回歸運算，求得大鼠標準曲線回歸方程為：Y=0.040 7X+0.0178（r =0.992 7）；食蟹猴標準曲線回歸方程為：Y=0.028 9X+0.002 28（r=0.996 5）。根據標準曲線，本法頭孢曲松鈉的線性范圍均為0.25～750 μg/ml，定量下限為0.25 μg/ml。結果表明，2標準曲線回歸方程間斜率相差近一倍，原因可能是大鼠與食蟹猴種屬間存在一定基質效應。

2.1.3 準確度與精密度

取SD大鼠和食蟹猴質控血漿樣品每個濃度各6份，并用隨行標準曲線計算測定的質控樣品濃度，與配制濃度對照，求得本法的準確度和精密度（表1）。結果表明，它們的RSD均小于12%。

2.2 SD大鼠PK試驗結果

在SD大鼠體內靜脈或肌肉注射羅氏芬和新亞產品的藥時曲線見圖2。采用Kinetica 5.1軟件非房室方法計算新亞和羅氏芬在大鼠給藥后的主要藥動學參數：相對生物利用度F =受試藥AUC0-t/參比藥AUC0-t×100%。采用配對t檢驗，比較新亞和羅氏芬的頭孢曲松鈉藥動學參數在給藥后的差異，Tmax采用非參數檢驗，其他參數經對數轉換后進行檢驗。

SD大鼠藥藥動學參數Tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞和t1/2在新亞和羅氏芬間無統計學差異（P>0.05，表2）。

2.3 食蟹猴PK試驗結果

在食蟹猴體內靜脈和肌肉注射羅氏芬或新亞產品的藥時曲線見圖2。根據Kinetica 5.1軟件非房室方法計算新亞和羅氏芬在食蟹猴給藥后的主要藥動學參數Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞和t1/2在新亞產品和羅氏芬間無統計學差異（P>0.05，表3）。

3 討論

本研究建立了定量測定SD大鼠及食蟹猴血漿中頭孢曲松鈉的UPLC-MS/MS方法。分別在ESI源和APCI源下，對頭孢曲松鈉采用正、負離子兩種檢測模式進行研究，比較響應信號強度。結果發現，頭孢曲松鈉在兩種離子化源的負離子掃描方式下，不易裂解，加大裂解能量后，雖然可產生碎片離子，但豐度很低而且不穩定，不適合做定量分析。而在正離子模式下，ESI源較APCI源可產生更高的靈敏度和更穩定的碎片。因此本研究選擇ESI源，發現在正離子檢測模式下質核比為396的離子峰豐度最高，而且穩定，與相關文獻報道相符合[11]。

為了提高分析靈敏度，改善峰形并縮短分析時間，分別嘗試用甲醇和乙腈作為流動相中的有機相，結果表明添加甲醇可降低背景噪音，提高待測物的響應度；嘗試了在水相中加入醋酸銨和甲酸溶液對峰形的影響，發現加入2 mmol/L醋酸銨可以改善峰形，而加入甲酸溶液后峰形變差；故選用2 mmol/L醋酸銨水溶液作為水相，甲醇溶液作為有機相。

在大鼠實驗中，將大鼠隨機分為兩組，采用了配對t檢驗的方式進行計算，但大鼠之間存在一定的個體差異，因此生物利用度的標準偏差偏大。在食蟹猴實驗中，采用交叉實驗，有可能是前后兩次肌肉注射位置存在差異，導致肌肉群的吸收會存在一定的差異性，因此其最大濃度點的標準偏差偏大。

本方法的專屬性好，靈敏度高，符合生物樣品的定量分析要求，分析時間僅為3 min，可為快速、準確地測定生物樣品中頭孢曲松鈉的血藥濃度提供有意義的參考。研究結果顯示，新亞和羅氏芬頭孢曲松鈉靜脈和肌肉注射給藥后，在SD大鼠和食蟹猴體內的藥代動力學性質接近，藥時曲線一致，主要藥代動力學參數Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞和t1/2未見顯著性差異。相對于羅氏芬，新亞在SD大鼠體內靜脈和肌肉注射的相對生物利用度分別為（89.1±98.6）%、（91.3±55.4）%、在食蟹猴體內分別為（94.0±9.6）%、（106.4±103.0）%。兩制劑在SD大鼠和食蟹猴體內生物等效。

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