氯沙坦減輕梗阻性腎病大鼠腎間質纖維化及腎小管上皮細胞凋亡機制的研究

何平，閔柳暢，張蓓茹，楊旭，蘇曉曉，李德天

（中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽 110004）

·論著·

氯沙坦減輕梗阻性腎病大鼠腎間質纖維化及腎小管上皮細胞凋亡機制的研究

何平，閔柳暢，張蓓茹，楊旭，蘇曉曉，李德天

（中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽 110004）

目的 探討氯沙坦對單側輸尿管梗阻大鼠模型腎小管上皮細胞凋亡和腎間質纖維化的影響及其可能機制。方法通過結扎并離斷大鼠單側輸尿管制作梗阻性腎病模型，對照組進行假手術。留取術后第3，5，7及14天腎臟組織及血尿標本。結果 單側輸尿管梗阻使α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達水平明顯增加，并導致腎小管間質纖維化和腎組織細胞凋亡明顯增加。腎間質纖維化的進展伴隨著STAT3的磷酸化和2種凋亡相關蛋白（Bax和Bcl-2）的表達改變。氯沙坦干預治療可以減少這些變化。結論 在單側輸尿管梗阻的大鼠模型中，氯沙坦能緩解腎臟纖維化及腎小管細胞的凋亡程度。這種療效可能是通過部分阻滯STAT3信號通路完成的。

腎間質纖維化；細胞凋亡；氯沙坦；STAT3信號通路；凋亡相關蛋白

腎小管間質纖維化是終末期腎病的共有階段，特點是腎臟成纖維細胞的增生與異常激活［1～4］。上尿路梗阻對腎臟的影響巨大，并且是兒童及成年人腎功能不全的一個重要原因［5］。即使及時的手術治療尿道梗阻仍然可能有不可逆的腎單位損傷。腎素血管緊張素醛固酮系統的抑制劑是否可以減輕腎間質的纖維化及腎小管上皮細胞的凋亡仍有爭議。本研究的目的在于評估梗阻性腎病大鼠模型中氯沙坦對腎纖維化進展及腎小管細胞凋亡的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 單側輸尿管梗阻模型制作和氯沙坦治療

飼養在盛京醫院實驗中心的健康成年雄性大鼠，在恒溫、相同光照下（光照周期為7時至18時），食物和水隨機提供。通過中線切口暴露腹腔，分離左側輸尿管并結扎離斷。動物實驗分為2部分。第1部分實驗分為5組。對照組（Sham組）的動物用同樣的手術步驟但不結扎輸尿管。另外4組（統稱模型組）大鼠分別在結扎輸尿管后的第3，5，7，14天被處死（分別為UUO3 d組，UUO5 d組，UUO7 d組和UUO14 d組）。第2部分實驗分為4組。對照組（Sham組），Sham+氯沙坦組，UUO7 d組，UUO7 d+氯沙坦組。氯沙坦溶解在水中通過灌胃法給予大鼠［4］。實驗結束時，所有大鼠麻醉后留取腎臟做免疫印跡分析或者組織學檢查。

1.2 腎臟的形態學觀察

標本固定后脫水，石蠟包埋，切片（4 μm），馬松三色染色后，光鏡下觀察腎臟形態。藍色顆粒和線性沉淀為膠原蛋白染色陽性。染色結果采用計算機圖像定量分析。

1.3 免疫印跡分析

組織樣本等量上樣。凝膠電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜上。封閉后，分別加入STAT3、p-STAT3一抗（1∶1 000稀釋，Cell Signaling公司）、Bcl-2（1∶500稀釋，Santa Cruz公司）、Bax（1∶500稀釋，Santa Cruz公司）、α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白（1∶1 000稀釋，Sigma公司）4℃搖床孵育過夜。加入相應二抗，進行ECL反應。一次性完成定影、顯形、圖像分析系統測定條帶的灰度值。

1.4 TUNEL檢測

圖1 模型組腎臟α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達Fig.1 Effect of UUO on the expression levels of renal typeⅠcollagen and α-SMA in the kidneys of rats subjected to UUO

腎組織石蠟切片厚約3 μm，按試劑盒所示步驟進行操作。凋亡細胞數計數：每張切片隨即選10個高倍視野（×400），分別檢測每個高倍視野內TUNEL陽性細胞數，求出平均每個高倍鏡視野內陽性細胞數，比較其均值。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 單側輸尿管梗阻導致腎臟細胞凋亡及α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達增加

Sham組大鼠腎臟的α-SMA表達水平可忽略不計。在模型組的表達水平明顯增加，第3天是Sham組的3倍，第14天是Sham組的9倍，見圖1。Ⅰ型膠原蛋白的表達水平也呈時間依賴性遞增的趨勢。Sham組腎臟無細胞凋亡。單側輸尿管梗阻3 d與Sham組相比，凋亡細胞數明顯增多。TUNEL染色陽性細胞數隨著梗阻時間的增長而持續增加，見圖2。

圖2 單例輸尿管梗阻導致腎臟細胞凋亡 ×400Fig.2 UUO lead to renal cell apoptosis×400

2.2 氯沙坦抑制梗阻性腎病STAT3的磷酸化

圖3 模型組腎臟STAT3的磷酸化水平Fig.3 Effect of UUO on the phosphorylation levels of STAT3

模型組腎臟中STAT3的磷酸化水平隨著時間的增加而提高，見圖3。其磷酸化水平在第14天的時候是對照組的9倍。氯沙坦的干預治療在第7天很大程度上降低了STAT3的磷酸化水平，見圖4。

圖4 氯沙坦干預后STAT3的磷酸化水平Fig.4 Effect of losartan on the expression and phosphorylation levels of STAT3 following UUO

2.3 氯沙坦抑制腎間質纖維化的發展

圖5 氧沙坦抑制腎間質纖維化的發展 ×400Fig.5 Effect of losartan on renal fibrosis×400

Masson染色（圖5）顯示，第7天的單側輸尿管梗阻的腎臟與Sham組相比間質纖維化水平明顯增加。氯沙坦的治療顯著降低了纖維化水平。定量分析顯示，Sham組的腎間質纖維化體積為（1.5± 0.5）%，模型組的腎間質纖維化體積為（15.7±3.2）%，氯沙坦干預后腎間質纖維化體積減少為（10.1± 1.8）%。α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達水平也被氯沙坦部分抑制，見圖6。

2.4 氯沙坦抑制梗阻性腎病腎小管細胞的凋亡和凋亡蛋白的表達

氯沙坦的應用能部分減輕腎小管上皮細胞凋亡，見圖7。同Sham組相比，梗阻7 d后Bax的表達水平明顯增高，Bcl-2的表達水平有所下降。應用氯沙坦干預治療后，Bax的表達水平較前下降，Bcl-2的表達水平有所上升，見圖8。

圖6 氯沙坦抑制α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達Fig.6 Effect of losartan on the expression levels of α-SMA and typeⅠcollagen

圖7 氯沙坦抑制梗阻性腎病腎小管細胞凋亡 ×400Fig.7 Effect of losartan on the levels of renal tubular cell apoptosis×400

圖8 氯沙坦抑制梗阻性腎病凋亡蛋白Bax，Bcl-2的表達Fig.8 Effect of losartan on the levels of Bax，Bcl-2

3 討論

本研究結果表明，氯沙坦能抑制輸尿管梗阻腎臟腎纖維化的增加，并減少細胞外基質的沉積和Ⅰ型膠原蛋白的表達。之前的研究表明，α-SMA激活的肌纖維母細胞是主要的效應細胞，是纖維化腎臟中細胞外基質沉積的原因。本研究的數據表明，應用氯沙坦能減輕單側輸尿管梗阻性腎病腎間質纖維化和α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白的表達水平。腎間質纖維化的進展是一個復雜的過程，與多種細胞的信號通路和分子因素有關［6］。本研究表明，在梗阻后的第3天，STAT3蛋白的磷酸化明顯增加，直到第14天達到頂峰。說明STAT3的磷酸化在介導腎間質成纖維細胞的活化和腎間質纖維化的進展中的重要性。數據還清楚地表明了氯沙坦干預治療能部分減弱STAT3信號通路活化及單側輸尿管梗阻造成的腎間質纖維化。本研究也表明，與Sham組大鼠的腎臟相比，在單側輸尿管梗阻誘導的腎損傷的腎臟中Bax/Bcl-2的比率（促凋亡信號）增高，腎臟組織凋亡細胞明顯增加。

本研究證實了Manucha等［7］的研究結果，其研究結果表明在梗阻性腎病的大鼠模型中，氯沙坦有減少Fas配體的表達水平及抗細胞凋亡的療效。本研究的細胞凋亡結果也由氯沙坦對STAT3信號通路的影響證實。

慢性腎臟病的發病率和患病率在世界范圍內不斷增加，其治療的主要目的是防止或減緩疾病的進展［8］。本研究結果提供了血管緊張素受體拮抗劑在減緩慢性腎臟病進展中作用的證據。結果表明在單側輸尿管梗阻的大鼠模型中氯沙坦能有效地減慢腎間質纖維化和細胞凋亡的水平。氯沙坦的抗纖維化作用及抗凋亡與STAT3信號通路的抑制有關。

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（編輯 于 溪）

Mechanism ofLosartan on RenalInterstitialFibrosisand RenalTubular EpithelialCellApoptosisin Ratswith Obstructive Nephropathy

HE Ping，MINLiu-chang，ZHANGBei-ru，YANGXu，SUXiao-xiao，LIDe-tian
（DepartmentofNephrology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the effects of losartan on renal tubular cell apoptosis and renal fibrosis in a rat model of UUO，and explore the related mechanism.Methods Rats were subjected to UUO by ureteral ligation and treated with dimethyl sulfoxide（control）or losartan.Controls were given sham operations.Renaltissues were collected 3，5，7，and 14 days aftersurgery formeasurementofvarious indicators ofrenalfibrosis.Re?sults UUO increased the expression ofα-SMA and collagenⅠ，and improved the extentofrenaltubularfibrosis and apoptosis in a time-dependent manner.Losartan treatment partially reversed these effects.Progression of renal interstitial fibrosis was accompanied by phosphorylation of signal transducerand activatoroftranscription 3（STAT3）and altered expression oftwo-apoptosis-related proteins（Bax and Bcl-2）.Losartan treatmentalso partially reversed these effects.Conclusion Our results indicate that losartan attenuates renal fibrosis and renal tubular cell apoptosis in a rat modelofUUO.Thiseffectappears to be mediated by partialblockage ofSTAT3 phosphorylation.

renal interstitial fibrosis；cell apoptosis；losartan；STAT3 signal pathway；apoptosis-related proteins

R695.1

A

0258-4646（2016）02-0136-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.009

遼寧省教育廳科學研究項目（L2013295）；遼寧省博士科研啟動基金（201501005）

何平（1978-），女，副教授，博士.

李德天，E-mail：lidetian@sj-hospital.org

2015-05-05

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