甲鈷胺片清潔驗證分析方法研究

徐鵬鶴，張婷，余永華，華潔，雷錦璟

1.杭州康恩貝制藥有限公司，浙江杭州310052；2.杭州新博思生物醫藥有限公司，浙江杭州310052；3.杭州新諾華醫藥有限公司，浙江杭州310052

甲鈷胺片清潔驗證分析方法研究

徐鵬鶴1，張婷2，余永華3，華潔1，雷錦璟1

1.杭州康恩貝制藥有限公司，浙江杭州310052；2.杭州新博思生物醫藥有限公司，浙江杭州310052；3.杭州新諾華醫藥有限公司，浙江杭州310052

目的建立甲鈷胺片清潔驗證分析方法及取樣方法。方法采用高效液相法，以Hypersil ODS2-C18（5 μm, 4.6×150 mm）為色譜柱，以0.05 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（83∶17）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為266 nm，進樣量為20 L，柱溫30℃。結果甲鈷胺對照品溶液在檢測濃度0.03~1.60 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.999），且回收率符合要求（回收率為99%）。結論該方法簡便、準確、重復性好，靈敏度高，可用于甲鈷胺片清潔驗證藥品殘留量的檢測。

甲鈷胺片；清潔驗證；方法學

甲鈷胺是一種內源性的輔酶B12，臨床用于治療周圍神經病。本品最早有衛材研發上市，國內上市劑型常見有片劑、膠囊和注射液，其中以片劑市場占有率最高。杭州康恩貝制藥有限公司生產的甲鈷胺片規格為0.5 mg。目前尚未有文獻表明相關的清潔驗證方法報道，工藝生產的清潔驗證其含量及濃度均較低，而甲鈷胺見光易分解，因此在檢測過程中易引起多種偏差。中國藥典2015版及現有文獻中甲鈷胺均采用高效液相色譜法進行含量測定，但色譜條件如流動相及檢測波長[1]等均存在多樣化。該文采用高效液相色譜法對甲鈷胺片進行生產清潔驗證分析方法開發及驗證，并對樣品進行分析測定。

1　儀器與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀（Waters，e2695/2498）；電子分析天平（Mettler-Toledo，XS105Dualrange）；pH計（Mettler-Toledo，DELTA320），除濕機（杭州弘泰電器有限公司）。

1.2試藥

乙腈(TEDIA,批號16030553，HPLC級)；乙酸銨（國藥集團化學試劑有限公司，批號20151207，分析純）；磷酸（上海凌峰化學試劑有限公司，批號20141218，分析純）；純化水（Milli-Q integral 10）。甲鈷胺（20160115，浙江省食品藥品檢定研究院標化）。棉簽（穩健醫療集團有限公司）；水系濾頭（Φ2.5 cm，0.45 μm，上海昊清科技有限公司）。

2　方法及結果

2.1色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS2-C18（5 μm,4.6×150 mm），流動相為0.05 mol/L乙酸銨溶液-乙腈（83∶17）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為266 nm，進樣量為20 L，柱溫30℃[2]。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液制備取甲鈷胺對照品28~200 mL量瓶中，精密稱定，加水振搖使溶解并至刻度；精密量取1 mL，置50 mL量瓶中,用水稀釋至刻度，搖勻，即得甲鈷胺對照品儲備液（濃度約2.8 μg/mL）。精密量取5~ 20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液（濃度約0.7 μg/mL）。

2.2.2供試品溶液制備取兩個用水濕潤的棉簽，輕輕壓住，在100 cm2的不銹鋼設備表面按圖1擦拭，擦拭結束后旋轉90°，按圖2擦拭,再取一個用水潤濕的取樣棉簽按相同方法擦拭1次。

圖1　擦拭方向（橫向）

圖2　擦拭方向（縱向）

將擦拭后的2個棉簽置燒杯中，精密量取10 mL水，超聲10 min；棉球擠干后取出，以0.45 μm水系濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.3方法學驗證

2.3.1系統適用性取對照品溶液照上述色譜條件連續進樣5針，以峰面積計，應符合標準要求：五針峰面積RSD≤2.0%，理論板數＞200 0，分離度R＞1.5。結果：五針峰面積RSD為0.7%，理論踏板數均＞2000，分離度均＞1.5。

2.3.2專屬性分別進空白溶液（即棉簽浸出液：取兩個棉簽置100 mL燒杯中，加水10 mL，超聲溶解10 min）、空白輔料溶液（取空白輔料同供試品溶液配制）和使用前用0.45 μm纖維素濾膜濾過）、對照品溶液，照上述色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖。要求：主峰分離度>1.5，純度角小于純度閾值，空白輔料及棉簽浸出液對主峰無干擾。結果，供試品主峰分離度符合要求（無雜質峰），峰純度符合要求（純度角0.917＜純度閾值1.264），溶劑、空白輔料及棉簽浸出液對主峰無干擾。見圖3。

圖3　空白溶液(A)、空白輔料(B)、甲鈷胺對照品溶液(C)色譜圖

2.3.3檢測限與定量限取甲鈷胺對照品儲備液，逐級稀釋，使甲鈷胺主峰信噪比約為3∶1和10∶1，記錄對應的對照品溶液濃度，即為對應的檢測限與定量限，照上述色譜條件進樣檢測，平行進樣2次。標準要求：檢測限信噪比約3∶1；定量限信噪比約10∶1。結果，檢測限為0.01 g/mL，定量限為0.03 g/mL。

2.3.4線性取對照品儲備液，用水逐步稀釋成定量限及限度范圍內制備不同濃度的溶液，濃度分別為定量限、0.4 μg/mL、0.7 μg/mL、1.0 μg/mL、1.4 μg/mL、1.6 μg/mL，照上述色譜條件進樣檢測分別進樣；并以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得線性方程。標準要求：r≥0.999。結果表明，甲鈷胺濃度在0.03 μg/mL～1.6 g/mL，范圍內與峰面積呈良好線性關系，r=0.999。

2.3.5準確度

2.3.5.1方法回收率取對照品儲備液，分別用水稀釋成限度的50%、100%、120%溶液，即為0.4 μg/mL、0.7 μg/mL和1.0 μg/mL，照上述色譜條件進樣檢測，每個濃度進樣兩針，平行實驗3次。標準要求：回收率應在95%～105%。結果：該法回收率良好，平均回收率99%。

2.3.5.2擦拭回收率取對照品儲備液，用水稀釋成4 μg/mL、7μg/mL和10 μg/mL的溶液。精密量取1 mL至3個10 cm×10 cm的不銹鋼板上，晾干，照供試品溶液制備方法進行制備并照上述色譜條件進樣檢測，平行實驗3次。標準要求：回收率≥50%。結果擦拭回收率良好，平均回收率75%。

2.3.6精密度取對照品儲備液用水稀釋成0.7 μg/mL的溶液，照上述色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積，計算其相對標準偏差（RSD），作為重復性。另以不同人員同法操作，以兩位操作者12針樣品的峰面積，計算12次的相對標準偏差，作為中間精密度。標準要求6份供試品溶液含量RSD≤2.0%；兩個QC之間所測得含量的結果偏差≤2.0%。結果，該法精密度良好，重復性RSD為0.3%，中間精密度，RSD為1.4%。

2.3.7溶液穩定性取對照品溶液和供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h照上述色譜條件進樣，進行含量測定。標準要求：對照品溶液回收率在95%～105%之間，樣品溶液峰面積與0 h樣品溶液峰面積偏差≤2.0%，則認為對照品溶液和供試品溶液是穩定的。結果，該法穩定性良好，在48 h內對照品溶液及供試品溶液偏差< 2.0%[3-4]。

3　討論

甲鈷胺溶液對光不穩定，本實驗在綜合摸索不同的實驗條件是，最終采用全程照度低于5 lx的紅色LED燈，因此該法檢測限可達0.01 g/mL，并保證最低量至限度范圍內（0.03~1.6 g/mL）良好的線性和準確度，因此對產品生產的清潔具有重大意義。

甲鈷胺在266 nm處有強烈的紫外吸收，用該波長進行測定，大大提高了甲鈷胺的檢測靈敏度，對生產更加個有指導意義。

該方法驗證是基于ICH和GMP的指導原則進行，由于不同人員的擦拭效果不一致，因此對清潔擦拭人員進行全面的培訓和考核。結果該法簡便、靈敏、專屬性強。

[1]（美）L.R.森德爾，J.J.柯克蘭，J.L.柯克蘭.實用高效液相色譜法的建立[M].張玉奎，王杰，張維冰，譯.2版.北京：華文出版社，2001：62-68.

[2]國家食品藥品監督管理總局.YBH12632004，甲鈷胺[S].北京：國家食品藥品監督管理總局，2014.

[3]桑國衛，陳竺，邵明立，等.藥品質量標準分析方法驗證指導原則·中國藥典四部[S].北京：國家藥典委員會，2015.

[4]International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use.Validation of analytical procedures:text and methodology ICH Q2(R1):November 2005.

Research on Validated Analytical Method of Mecobalamin Tablets Cleaning

XU Peng-he1,ZHANG Ting2,YU Yong-hua3,HUA Jie1,LEI Jin-jing1
1.Hangzhou Conba Pharmaceutical Co.,Ltd,Hangzhou,Zhejiang Province,310052 China；2.Hangzhou New Allen Biotechnology Co.Ltd,Hangzhou,Zhejiang Province,310052 China；3.Hangzhou new Novartis Pharmaceutical Co.,Ltd.Hangzhou, Zhejiang Province,310052 China

Objective To establish a validated analytical method of mecobalamin tablets cleaning and sampling method. Methods The high performance liquid chromatography was adopted with Hypersil ODS2-C18(5 μm,4.6×150 mm)column, with 0.05 mol/L ammonium acetate solution-acetonitrile(83∶17)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The absorbance was monitored at 266 nm.The injection volume was 20 μl and the column temperature was 30℃.Results The liner correlation of mecobalamin contrast solution was good from the 0.03 μg/mL to 1.60 μg/mL detection concentration R= 0.999,and the recycle rate met the requirement(the recycle rate was 99%).Conclusion The method is simple and accurate with good repeatability and high sensitivity,which can be used in the detection of mecobalamin tablets in the cleaning validation of drug residue.

Mecobalamin tablets;Cleaning validation;Methodology

R96

A

1672-5654（2016）11（a）-0050-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.31.050

徐鵬鶴（1982.4-），男，浙江淳安人，本科，工程師，研究方向：藥物質量標準及分析方法學研究。

（2016-08-05）