CD105和ki67在人卵巢癌細胞中的表達并確定表達部位

郭海榮，李增山，賀 帥，王小燕，劉 萍

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CD105和ki67在人卵巢癌細胞中的表達并確定表達部位

郭海榮1，李增山2，賀 帥3，王小燕1，劉 萍1

(1.內蒙古醫科大學第三附屬醫院，內蒙古 包頭014010；2.第四軍醫大學基礎部病理學教研室，陜西 西安710032；3.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院病理學教研室，內蒙古 包頭014060)

目的 檢測CD105和Ki67在人卵巢癌細胞中的表達情況及確定其表達部位。方法 采用Western blot篩選出6種人卵巢癌細胞系中CD105和Ki67均高表達的細胞系；并用免疫熒光染色法明確CD105和Ki67在細胞內的表達部位。結果 CD105和Ki67在人卵巢癌OVCAR3細胞中均高表達；CD105主要表達于OVCAR3細胞的細胞質和細胞膜，Ki67主要表達于OVCAR3細胞的細胞核。結論 人卵巢癌OVCAR3細胞中CD105和ki67均呈高表達，CD105定位于細胞質和細胞膜，ki67定位于細胞核，為進一步研究CD105和ki67在卵巢癌發生發展中的作用機制奠定基礎。

CD105；ki67；OVCAR3；Western blot；免疫熒光染色

卵巢上皮癌(ovarian epithelial carcinoma，EOC)是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]，發生于盆腔深部，表面沒有包膜，容易發生轉移及種植，大多數卵巢癌患者發現時即是晚期，因此，尋找敏感的腫瘤標志物，早期發現腫瘤，是目前卵巢癌研究領域的熱點。所有腫瘤細胞的侵襲和轉移均離不開新生的毛細血管，CD105參與了新生毛細血管的形成，是目前有效的毛細血管標記物[2]，能很好的反映毛細血管的生長。Ki67是反映腫瘤細胞增殖的因子，其高表達與惡性腫瘤的分化、侵襲及預后密切相關[3]。以往關于CD105和Ki67在卵巢癌中的研究多局限于組織水平，本文以人卵巢癌細胞為研究對象，研究CD105和Ki67在體外培養的人卵巢癌細胞系中的表達情況及定位，為進一步研究CD105和ki67對卵巢上皮癌細胞增殖、凋亡等生物學活性的影響奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料及主要試劑

人上皮性卵巢癌細胞系OVCAR3、SKOV3TRp2、HIO-180和ES2購自中科院上海細胞庫；人上皮性卵巢癌細胞系HeyA8MDR和A2780ip2購自美國組織培養采集中心；RPMI1640培養基(Gibco-BRL)、胎牛血淸(Gaithersburg，MD)、硫酸鏈霉素/氨芐青霉素(Gaithersburg, MD)、兔抗人CD105單克隆抗體(abcam cambridge，UK)、鼠抗人Ki67單克隆抗體(abcam，cambridge，UK)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(abcam cambridge，UK)、Western Blot抗兔二抗、抗鼠二抗購自武漢晟亞生物技術有限公司。PVDF 膜(millipore NY，USA)熒光抗鼠、抗兔二抗(invitrogen NY，USA)，Hoechst33258 染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的培養

OVCAR3、HeyA8MDR、SKOV3TRp2、A2780ip2、HIO-180及ES2卵巢癌細胞常規培養于RPMI-1640培養基中(FBS濃度為20%，青霉素和鏈霉素各100ng/mL)，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，每隔48h換液1次，待細胞生長完全融合后，按照1:3的比例傳代或凍存。

1.2.2Western Blot方法檢測各細胞內CD105、Ki67蛋白的表達

將已完全融合的6孔板細胞置于冰上，每孔加入2×loading buffer 100μL，混勻，細胞刮反復刮下貼壁細胞移至Ep管內，超聲破碎儀裂解細胞，100℃加熱10min，分裝，-20℃保存備用。取蛋白樣品，6%、8%SDS-PAGE電泳分離并轉移至PVDF膜，將標記好正反面的PVDF膜在脫脂奶粉中封閉30min，PBST清洗3×5min，在正面加一抗，4℃過夜；PBST清洗后在PVDF膜正面加二抗，37℃1h，洗完膜后按1:1加入發光A、B液，均勻滴于濾膜上，作用5min。在暗室中操作X光片壓片、曝光、顯影、定影。

1.2.3細胞免疫熒光方法檢測CD105、Ki67均高表達人卵巢癌細胞中具體表達部位

將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5 min，室溫18℃～26℃過夜干燥后置入6孔板，將完全融合的細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，待細胞達30%～50%融合后，取出玻片，1×PBS洗滌3次，每次5min，4%多聚甲醛固定15min，1%Triton X-100行破膜處理10min，1×PBS洗滌3次，每次5min，用含5%羊血清的BSA室溫下封閉30min，一抗孵育，4℃過夜，FITC標記的二抗孵育37℃、黑暗環境2h ，Hoechst33258核染色3min，封片，黑暗環境中在熒光顯微鏡下觀察。CD105、Ki67的一抗分別按照1:300、1:200稀釋。根據實驗需要選用相應FITc(紅色或綠色熒光)標記的二抗，按1:500稀釋，對每張染色片均另外各取2張作陰性對照，分別不加一抗和不加一抗及二抗，以PBS代替。

2結果

2.1Western Blot檢測實驗結果

采用Western blot方法分別檢測這6種人卵巢癌細胞系中CD105、Ki67的蛋白表達水平的情況，結果發現：選取的6種癌細胞中只有OVCAR3細胞中CD105、Ki67均呈高表達,見圖1。

圖1 6種人卵巢癌細胞系中CD105、Ki67蛋白表達情況

Fig.1 The protein expressions of CD105 and Ki67 in six ovarian cancer cell lines

2.2免疫熒光檢測人卵巢癌OVCAR-3細胞中CD105、Ki67的表達部位

以往研究發現，CD105蛋白主要定位于細胞漿，Ki67蛋白則主要定位于細胞核內。通過第一步實驗可以得知：在選取的6種人卵巢癌細胞中，只有OVCAR3細胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表達，為進一步驗證這兩種蛋白在人卵巢癌OVCAR3細胞的表達及分布情況，應用細胞免疫熒光技術檢測，檢測結果見圖2所示：熒光顯微鏡下可以清晰看到的紅色熒光，表明細胞與Cy3(紅色)熒光標記的抗CD105抗體結合，與Hoechst33258染核的藍色熒光組成一個完整的細胞形態。熒光顯微鏡下清晰看到的綠色熒光，表明細胞與FITC(綠色)熒光標記的抗Ki67抗體結合，且與Hoechst33258染核的藍色熒光完全重合，說明在人卵巢癌OVCAR3細胞中，CD105主要表達于細胞漿和細胞膜，Ki67則主要表達于細胞核。

Cy3-CD105

Hoechst

merged

FITC-Ki67

Hoechst

merged

注：A-1抗人抗體與OVCAR3胞漿上CD105結合，表現為胞漿內散在分布的紅色熒光; A-2 僅用DAPI染細胞核;A-3用DAPI復染細胞核；B-1抗人抗體與OVCAR3細胞核內的Ki67結合，表現為胞核內散在分布的綠色熒光; B-2 僅用DAPI染細胞核;B-3用DAPI復染細胞核。

圖2 CD105、Ki67蛋白在人卵巢癌OVCAR3細胞的表達及分布情況(放大倍數：400)

Fig.2 Expression and distribution of CD105 and Ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cells (×400)

3討論

3.1 對CD105的研究現狀

CD105(endoglin)，分子量180kDa，是由二硫鍵連接的同型二聚體跨膜糖蛋白，更多分布在增殖的內皮細胞。在惡性腫瘤包括卵巢癌，白血病，胃腸道間質瘤，黑色素瘤，和喉癌等腫瘤的血管內皮高表達，但很少表達于非內皮細胞[4-5]。目前國內外主要集中在研究腫瘤中CD105作為血管形成分子的角色和它作為腫瘤中微血管密度標記的作用[6]。

3.2對Ki67的研究現狀

細胞增殖是腫瘤發生發展的一個重要的因素。Ki67抗原除G0期(細胞休眠期)，可表達在所有細胞周期階段[7-8]。Ki67蛋白表達對腫瘤預后的影響及同腫瘤臨床病理特征的關系提示在多種不同種類的癌癥中起到重要作用[9]。因此Ki67是一個細胞增殖較為可靠的標志。以往的研究顯示Ki67增生指數同一些癌癥不良的遠期無病存活和總體存活相關[10-12]。國外有研究表明，在卵巢惡性腫瘤中，細胞核內Ki67的表達>30%，預示Ki67在進展期卵巢癌中呈高表達[13]。

3.3對CD105、Ki67在體外培養人卵巢癌細胞系中的表達及部位研究

從上述實驗結果可以看出，以β-actin為內參，所選取的6種體外培養的人卵巢癌細胞系中，在OVCAR3細胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表達。據文獻報道：CD105和Ki67共同強表達于腫瘤增殖活躍的內皮細胞，在表達腫瘤細胞增殖狀態方面具有統一性[13]。目前CD105及Ki67已經被用于多種腫瘤的增殖程度的檢測，臨床上聯合檢測CD105及Ki67可能對于判斷卵巢癌的惡性程度及預后有很大的幫助。

本實驗中，采用體外培養人卵巢癌細胞，檢測CD105及Ki67的表達。發現在OVCAR3細胞中二者均呈高表達；并且在OVCAR3細胞中CD105主要表達于細胞漿和細胞膜，Ki67則主要表達于細胞核。與既往在卵巢上皮癌組織病理切片中檢測的CD105及Ki67的表達部位相符[14]。為下一步實驗提取CD105及Ki67蛋白奠定實驗基礎。

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[專業責任編輯：安瑞芳]

Expression and location of CD105 and ki67 in human ovarian cancer cell lines

GUO Hai-rong1, LI Zeng-shan2, HE Shuai3, WANG Xiao-yan1, LIU Ping1

(1.The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Baotou 014010, China; 2. Department of Pathology,The Fourth Military Medical University，Shaanxi Xi’an 710032；3. Department of Pathology,School of Basic Medical and Forensic Science, Baotou Medical College, Inner Mongolia Baotou 014060, China)

Objective To investigate the expressions of CD105 and ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines and their location. Methods Cell lines with high expressions of CD105 and Ki67 were screened with Western blot from six human ovarian cancer cell lines. Immunofluorescene labelling assay was employed to investigate the location of CD105 and ki67 protein in OVCAR3 ovarian cancer cell lines. Results CD105 and Ki67 were both highly expressed in OVCAR3 cells lines. CD105 was mainly expressed in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 was mainly expressed in the nucleus. Conclusion CD105 and ki67 are highly expressed in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines. CD105 is located in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 is located in the nucleus, which lay the foundation for the mechanism study of CD105 and ki67 in the development of human ovarian cancer.

CD105; ki67; OVCAR3; Western blot; immunofluorescence

2015-07-01

內蒙古自治區自然科學基金資助項目(2012MS1134)

郭海榮(1971-)，女，主任醫師/碩士生導師，主要從事婦科腫瘤的研究。

劉 萍，教授/主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.038

R737.3

A

1673-5293(2016)09-1139-03