全肝CT灌注成像評估兔肝VX2瘤有效灌注及與不成對動脈的相關性*

劉智俊，龍學穎，劉慧，廖華之

（1.南華大學附屬第一醫院放射科，湖南衡陽421001；2.中南大學湘雅醫院放射科，湖南長沙410008）

全肝CT灌注成像評估兔肝VX2瘤有效灌注及與不成對動脈的相關性*

劉智俊1，龍學穎2△，劉慧2，廖華之1

（1.南華大學附屬第一醫院放射科，湖南衡陽421001；2.中南大學湘雅醫院放射科，湖南長沙410008）

目的分析兔VX2肝腫瘤模型的全肝CT灌注成像灌注參數與不成對動脈（UAs）的相關性，為探討腫瘤血管生成狀況及與灌注成像表現的本質聯系提供依據。方法采用健康清潔級新西蘭大白兔55只，其中假手術對照組5只，剔除經解剖和病理證實為未成功手術成瘤的，最終實驗組動物為42只。術后2周獲得兔VX2肝腫瘤邊緣、瘤周肝及假手術組的肝臟灌注血流量（BF）、肝臟灌注血容量（BV）、肝動脈灌注量（ALP）、門靜脈灌注量（PVP）、肝動脈灌注指數（HPI）等參數值，并于檢查后通過免疫組織化學染色獲得腫瘤標本的UAs值。結果實驗組VX2瘤邊緣BF、BV、ALP、PVP、HPI與實驗組瘤周肝比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；實驗組瘤周肝各灌注成像參數值與假手術對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP與UAs呈負相關（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP與UAs的相關系數最高（r=0.635，P<0.01）。結論全肝CT灌注可定量評估兔肝VX2瘤的肝動脈和門靜脈灌注信息，并可在一定程度上反映腫瘤血管生成狀況。

肝腫瘤，實驗性；動脈；免疫組織化學；體層攝影術，X線計算機；血液灌注；新生血管化，病理性；兔

腫瘤血管生成是腫瘤發生發展的標志和關鍵進程[1]。因此，準確評價腫瘤的血管生成與腫瘤微循環狀況是進行腫瘤評估的重要內容。而肝腫瘤血管生成的主要來源為腫瘤自身的新生血管生成和肝竇的毛細血管化[2]。目前以CT灌注成像為代表的全臟器容積灌注成像可無創傷性定量評估腫瘤的微循環狀況，其潛在意義不僅可以輔助判斷血管成熟度及預測抗血管生成療效，而且有望幫助聯合治療策略的選擇及監測靶向治療療效。但目前探討灌注參數與腫瘤血管成熟度有關的研究不多。故本實驗擬采用兔VX2肝腫瘤模型研究全肝CT灌注成像與腫瘤血管生成之間的本質聯系，對于探討肝腫瘤血管生成的基礎及CT灌注成像在體評估價值有一定的作用，也將為今后肝腫瘤血管生成的在體影像學評估提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物采用健康清潔級新西蘭大白兔55只，體質量（2.50±0.25）kg，由中南大學湘雅三醫院動物實驗中心提供。隨機選5只作為假手術對照組，剔除經解剖和病理證實為未成功手術成瘤的，最終實驗組動物為42只。

1.2方法

1.2.1實驗組動物建模采用開腹法[3]制作兔肝VX2瘤動物模型并對已行手術的實驗兔雙側耳朵內側進行逐一編號。

1.2.2雙源CT檢查于術后2周對已建模的實驗組兔及假手術對照組兔全身麻醉后，行全肝CT灌注成像[西門子雙源64層螺旋CT（somatom definition syngo CT 2010A），配置有相應后處理工作站syngo mulimodality workplace]。先掃出定位圖像，同時調整好對比劑用量為1 mL/kg，生理鹽水為5 mL，對比劑注射采用美國雙筒高壓注射器（mallinckrodt optivantage TM），注射速率為1 mL/s（對比劑注射方法參考相關文獻[4]進行選擇）。確保掃描野包含整個肝臟（膈頂至肝下緣）后，團注對比劑并采用雙源螺旋CT容積搖籃床式掃描方法，即無縫連續動態往復掃描模式，掃描參數為：延遲時間6 s后機器開始掃描，總掃描時間為61 s，球管每周旋轉時間0.33 s，管電壓80 kV，管電流50mAs，探測器寬度48mm，螺距1.0mm；圖像重建層厚為1.5mm，層間距為1.5 mm，重建矩陣為512×512，卷積核值為B30f。每次雙源螺旋CT掃描灌注成像共計生成完整原始數據30組，每組31幅圖像，將其全部輸入西門子雙源螺旋CT后處理工作站中。

1.2.3圖像后處理根據CT應用中的VPCT Body灌注軟件中的肝臟灌注應用模塊，然后結合文獻[5-6]的報道及軟件操作說明，將腹主動脈定義為輸入動脈，門靜脈定義為輸入靜脈，按步驟計算得出肝臟灌注血流量（BF）、肝臟灌注血容量（BV）、肝動脈灌注量（ALP）、門靜脈灌注量（PVP）、肝動脈灌注指數（HPI）等雙源螺旋CT灌注彩色數據圖像。在增強動脈期上腫瘤實質達強化峰值時選取腫瘤周邊較明顯強化的區域，在其區域內定義感興趣區（ROI）[4]，以避開腫瘤壞死區及周圍鄰近正常肝組織，并測量3次相同大小的ROI，通過計算機自動計算得出三組灌注參數值并取其平均值，以減少取樣誤差；瘤周肝區域的ROI為CT增強及灌注上尚未出現明顯的形態學改變，并病理證實無轉移[5]，ROI大小同前，同樣測量3次，并得出三組灌注參數值，然后取其平均值；最后以腫瘤邊緣區及相應瘤周肝的各灌注參數平均值作為結果記錄。somatom definition syngo CT 2010A的VPCT Body灌注軟件對各參數的計算方法采用的是斜率法[6]。

1.2.4定量不成對動脈（UAs）腫瘤的ROI選擇將參考標本剖面所見情況，并在周邊明顯強化的區域選取“熱點”，以避開中心壞死區，用來評估腫瘤的新生血管。VX2腫瘤內新生細動脈，即UAs，定義為腫瘤實質內α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）染色陽性的血管，且不伴有明顯的纖維組織或門靜脈及膽管，并且滿足α-SMA染色陽性的膜厚度與最小的管腔外徑的比值大于1/10，以排除靜脈。具體方法參照文獻[7-8]進行，先在低倍鏡（40×）下觀察整個切片，尋找腫瘤內新生血管最多處，即“熱點”，然后在高倍鏡（200×）下計數，記錄5個視野內UAs的總數。

1.3統計學處理應用SPSS19.0統計軟件對所有數據進行分析處理，數值變量數據均以±s表示。兔肝VX2瘤邊緣與腫瘤周邊肝組織的CT灌注參數值之間的差異采用兩配對樣本t檢驗，實驗組腫瘤周肝與假手術對照組肝灌注參數的差異采用兩樣本t檢驗；VX2腫瘤的全肝CT灌注各參數值與UAs的相關性采用Pearson積差相關系數相關法來分析[9]。以假設檢驗水準α=0.05（雙側），所有統計結果均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組織化學法檢測結果42只荷瘤兔腫瘤的UAs為（47.05±7.51）個，見圖1a～b。

圖1　α-SMA染色結果（200×）

表1　兔肝VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術對照組全肝CT灌注參數比較（±s）

表1　兔肝VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術對照組全肝CT灌注參數比較（±s）

注：實驗組瘤邊緣為兔肝VX2腫瘤周邊的參數值，實驗組瘤周肝為瘤周肝組織的參數值，假手術對照組肝為未種植腫瘤的假手術相應部位正常肝組織的參數值。與實驗組瘤周肝比較，aP＜0.05；與假手術對照組比較，bP<0.05，cP>0.05。

組別BF [mL/（100 mL·min）] n BV（mL/100 mL）ALP [mL/（100 mL·min）] PVP [mL/（100 mL·min）] HPI（%）實驗組瘤邊緣實驗組瘤周肝假手術對照組42 42 5 243.98±73.43ab206.92±74.07c204.54±2.74 24.36±7.43ab20.67±7.71c19.62±2.03 65.43±9.46ab42.43±7.77c40.43±1.45 14.43±2.31ab121.95±9.53c119.39±5.39 81.97±3.12ab15.66±0.29c25.30±0.37

2.2VX2瘤邊緣、瘤周肝及假手術對照組全肝CT灌注成像參數值比較實驗組VX2瘤邊緣BF、BV、ALP、PVP、HPI與實驗組瘤周肝及假手術對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；實驗組瘤周肝各灌注成像參數值與假手術對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1、圖2a～f。

圖2　VX2瘤動脈期增強圖及灌注彩圖

2.3VX2瘤邊緣全肝CT灌注成像定量參數值與UAs的相關性BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關（r=0.475、0.434、0.635、0.323，P＜0.05或0.01），PVP與UAs呈負相關（r=-0.365，P＜0.05）。其中以ALP與UAs的相關系數最高（r=0.635，P<0.01）。見表2。

表2　VX2瘤邊緣全肝CT灌注成像參數值與UAs相關性

3　討論

VX2瘤兔肝接種成瘤因建模簡便易行、成功率高、周期短、腫瘤生長增殖活躍、腫瘤血管生成豐富，成為原位肝腫瘤研究的常用腫瘤模型之一[5，10]。在應用該模型上，一部分研究因該模型肝腫瘤對比增強影像學上增強早期強化明顯而類似肝細胞癌（HCC），認為其為富血供肝腫瘤[1，4]，而另有學者因該腫瘤在穩定成瘤后的典型強化方式為環形強化而類似肝轉移瘤，推測其為乏血供腫瘤[11]。存在的這種分歧提示，對兔肝VX2瘤影像學上發現的血供特點仍然需要從腫瘤血管生成的層面進行更深入的分析。本實驗研究結果表明，瘤周肝組織與假手術對照組肝組織各灌注參數差異無明顯統計學意義，提示開腹假種瘤手術本身并未對背景肝臟的灌注狀態產生顯著影響，腫瘤區域的血流動力學應主要歸因于腫瘤所致。實驗組腫瘤邊緣的灌注參數與瘤周肝、假手術對照組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），表明邊緣有活力的腫瘤區域的相關血流動力學發生了顯著變化。本實驗研究結果與其他類似研究的結果相符，其中，腫瘤邊緣的BF、BV增高的主要原因可能是由于腫瘤新生血管的形成，使腫瘤邊緣區域的血管數量較周邊正常肝組織增加；此外，腫瘤血管形態不同于正常的肝組織血管，腫瘤血管通常粗細不均并有較多異常分支，其內皮細胞基底膜不完整致腫瘤血管滲透性增加等。上述原因造成大量對比劑進入腫瘤內，從而導致腫瘤的BF和BV增加[12]。而腫瘤邊緣PVP較瘤周肝及假手術對照組顯著降低，ALP、HPI較明顯高于瘤周肝及假手術對照組，其主要原因可能是在腫瘤內的動脈與門脈之間的血供比例發生了改變，腫瘤生長壓迫肝竇致使門靜脈壓力增高，繼而使腫瘤的PVP減少；而與此同時，腫瘤可能通過肝竇的毛細血管化[13]來增加腫瘤的ALP，以代償PVP減少的部分。因此，CT灌注成像結果提示，兔肝VX2瘤仍然主要是從動脈獲得相應的血供而不是門靜脈，其血供明顯高于鄰近肝組織，為一富血供腫瘤，從這一點看，兔肝VX2瘤與臨床上HCC血供特點有相似之處[14]。但這種血供基礎需要進一步從病理與免疫組織化學水平進行探討。

肝臟的組織結構相對較為特殊，除肝動脈外，也有門靜脈、膽管、肝靜脈及其各級分支等管道存在，其中在正常肝組織內肝動脈、門靜脈、膽管呈伴行關系，而肝靜脈則不伴行。故學者們引入UAs的概念，排除靜脈，以更好地評價肝腫瘤的血供特點[7，15]。對HCC的臨床研究[7]表明，在CT三期增強掃描上，UAs與動脈期腫瘤的強化程度呈明顯正相關；而HCC的對比劑增強超聲造影臨床研究[14]也發現UAs與多種超聲灌注參數值，包括最大強度值（IMAX）、上升時間（RT）、達峰值時間（TTP）、平均通過時間（mTT）、上升斜率（RS）、廓清時間（WT）均有相關性。本實驗得到的VX2瘤CT灌注成像定量參數與UAs的相關性分析結果表明，UAs與BF、BV、ALP、HPI均呈正相關性，其中以與ALP的相關系數最高，而與PVP呈弱負相關。因此，研究結果提示，全肝CT灌注參數BF、BV、ALP、HPI可在一定程度上反映UAs量的多少。而經免疫組織化學檢查證實，本實驗發現兔VX2肝腫瘤內有豐富的UAs，BF、BV、ALP、HPI與UAs呈正相關，可以推測腫瘤內有功能的新生細血管仍然是其動脈血供增加的重要病理基礎之一，這與Himeno等[15]報道肝癌內的新生腫瘤細動脈有可能是肝癌血管造影的具有顯著動脈血供的病理基礎相似。盡管α-SMA染色陽性的UAs計數主要反映血管的成熟度，但這種新生細血管畢竟不同于正常血管，仍然可能未完全被周細胞覆蓋，其內皮細胞基底膜不完整，從而使血管的滲透性增加；此外，血管直徑粗細不一，并有較多的異常分支、吻合支及動靜脈瘺形成也可能是重要原因之一。UAs另一重要作用在于其排除了門靜脈血流的影響，故UAs與PVP呈負相關，更從免疫組織化學水平說明了兔VX2肝腫瘤供血主要是肝動脈供血而非門靜脈。

綜上表明，兔肝VX2瘤的腫瘤血管生成復雜，全肝CT灌注參數可定量評估兔肝VX2瘤的肝動脈和門靜脈灌注信息，并可在一定程度上反映其腫瘤血管生成狀況。

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Total liver CT perfusion imaging for assessing correlation between rabbit liver VX2 tumor effective perfusion and unpaired arteries*

Liu Zhijun1，Long Xueying2△，Liu Hui2，Liao Huazhi1
（1.Department of Radiology，First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China；2.Department of Radiology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To analyze the correlation between the parameters of total liver CT perfusion imaging in rabbit VX2 liver tumor model and unpaired arteries（UAs）to provide a basis for the intrinsic contact between the tumor angiogenesis status and perfusion imaging manifestations.Methods Fifty-five healthy clean class New Zealand while rabbits were adopted.A-mong them，5 cases were in the sham operation control group，those were removed due to un-succeeded operative tumor formation verified by anatomy and pathology，and 42 cases were finally the experimental animals.The parameters of blood flow（BF），blood volume（BV），arterial liver perfusion（ALP），portal liver perfusion（PVP）and hepatic perfusion index（HPI）of the tumor rim，surrounding liver tissue and sham-operated group were obtained at postoperative 2 weeks.After the examination，the UAs values of tumor specimens were obtained by immunohistochemical staining.Results BF，BV，ALP，PVP and HPI had statistically significant differences between the tumor rim and the paracancerous liver tissue（P<0.05），but which had no statistically significant difference between the paracancerous liver tissues in the experimental group and the sham operation group（P>0.05）.BF，BV，ALP and HPI had positive correlation with UAs（r=0.475，0.434，0.635，0.323，P<0.05 or 0.01），PVP had negative correlation with UAs（r=-0.365，P<0.05）.Among them，ALP had the highest correlation coefficient with UAs（r=0.635，P<0.01）.Conclusion Total liver CT perfusion can quantitatively evaluate the liver artery and portal vein perfusion information of the rabbit liver VX2 tumor，and can reflect the status of tumor angiogenesis to some extent.

Liver neoplasms，experimental；Arteries；Immunohistochemistry；Tomography，X-ray computed；Hemoperfusion；Neovascularization，pathologic；Rabbit

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.002

A

1009-5519（2016）21-3263-04

國家自然科學基金資助項目（30800266）。

劉智?。?986-），碩士研究生，主要從事腹部疾病影像診斷的相關研究。

△，E-mail：280413177@qq.com。

（2016-08-11）