不同濃度白色念珠菌連續培養對比觀察*

葉合敏，李帥，向洋，付豪，杜永洪

（重慶醫科大學生物醫學工程學院/省部共建國家重點實驗室培育基地/重慶市超聲醫學工程重點實驗室，重慶400016）

不同濃度白色念珠菌連續培養對比觀察*

葉合敏，李帥，向洋，付豪，杜永洪△

（重慶醫科大學生物醫學工程學院/省部共建國家重點實驗室培育基地/重慶市超聲醫學工程重點實驗室，重慶400016）

目的通過對比觀察白色念珠菌（白念珠菌）在LB營養瓊脂培養平板上不同濃度的生長情況，探討白念珠菌平板稀釋法計數的適宜觀察濃度。方法將白念珠菌原液稀釋至約1.5×109cfu/mL，編號為A。然后取7個20 mL的無菌試管，每個試管加入9 mL無菌生理鹽水，分別編號為B～H。從A試管中吸取1 mL菌液至B管，混勻后再吸取1 mL至C管，如此連續倍比稀釋至H管。用移液槍吸取100 μL不同濃度的白念珠菌懸液到對應編號的一次性瓊脂培養平板，用接種環涂抹均勻，置于37℃孵箱內培養。結果培養48 h后，濃度數量級為104的白念珠菌較濃度數量級為102、103菌體密集且體積小，而105較104更密集、體積更小，呈針尖狀，肉眼不易觀察具體形態。白念珠菌濃度數量級為102、103時，真菌數量為20～300個，可以計數，而濃度數量級達104及以上時，則不能計數。分別培養24、48、72 h后取出瓊脂培養平板觀察，培養24 h后肉眼可觀察到菌落，但具體形態不明顯；培養48 h后較24 h時體積大，大致形態可看出，呈乳白色圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，有光澤，直徑為1.0～2.0 mm；培養72 h后較培養48 h后體積稍大，但呈現黃色。結論

菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法的適宜計數濃度，培養48 h后為菌落形態觀察的最佳時機。

白念珠菌；集落計數，微生物；體外研究；培養基；瓊脂

白色念珠菌（白念珠菌）因各種原因引起的機體免疫力下降或菌群失調時，可引起假絲酵母菌病。白念珠菌為最常見的真菌致病菌[1]，致病機制尚未明確，初步認為白念珠菌致病力與其黏附能力、形態轉變、產生有毒性的多種酶、產生抑制免疫活性細胞趨化作用的代謝產物有關[2]。目前，對白念珠菌引起的相關疾病主要通過藥物治療，但存在毒性反應大、治療周期長、易產生耐藥性等缺點[3]。通過對白念珠菌的培養，可了解其生長周期與基本特性，為確定白念珠菌在營養瓊脂培養平板上培養的最適觀察時間及其平板稀釋法最理想計數濃度提供條件，也為體外研究治療白念珠菌疾病的新方法提供支持。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗設備HD-650-u超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司，規格650mm×680 mm×625mm）、HZ-9211K恒溫振蕩器（江蘇省太倉市科教器材廠）。

1.1.2實驗材料白念珠菌菌株購自上海寶錄生物科技有限公司，LB肉湯、LB營養瓊脂、0.9%氯化鈉（NaCl）溶液、一次性培養平板（直徑9 cm）、10 mL刻度吸管、1.5 mL EP管、接種環。

1.2方法

1.2.1瓊脂培養平板的制備參照LB營養瓊脂配制方法，按40 g/L將粉末狀LB營養瓊脂在燒瓶中進行溶解，充分混勻消毒[4]后，液體處于60～70℃時在超凈臺上取13 mL于一次性培養平板中，靜置凝固后瓊脂厚度3～4 mm，密封保存于4℃冰箱中待用[5]。

1.2.2白念珠菌原菌液制備按25 g/L將粉末狀LB肉湯在燒瓶中進行溶解，充分混勻消毒冷卻至室溫。在超凈工作臺上，用接種環挑取瓊脂培養平板中培養48 h的最大白念珠菌1～2個接種于液體培養基中[6]，調節恒溫搖床振蕩器在150 r/min、37℃條件下搖菌13～15 h。

1.2.3制備不同濃度的菌液在超凈工作臺上，用移液槍吸取1 mL白念珠菌菌液，無菌生理鹽水稀釋，用比濁法對比菌液濃度，制備成原菌液濃度約為1.5×109cfu/mL，并編號為A。然后取7個20 mL的無菌試管，分別編號為B、C、D、E、F、G、H，再分別加入9 mL無菌生理鹽水。（1）用刻度吸管從A試管中取1 mL白念珠菌原菌液，加入B試管，混勻，B試管菌液稀釋濃度約為10倍（比濁法得菌液濃度約為1.5×108cfu/mL）；（2）用刻度吸管從B試管中取1 mL白念珠菌菌液，加入C試管，混勻，C試管的菌液稀釋濃度約為102倍（菌液濃度約為1.5× 107cfu/mL）；（3）重復該操作至H試管，H試管的菌液稀釋濃度約為107倍（菌液濃度約為1.5×102cfu/mL）。以上菌液濃度約為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5× 104、1.5×103、1.5×102cfu/mL的白念珠菌菌液配置完畢。

1.2.4白念珠菌平板接種在超凈工作臺上，用移液槍吸取100 μL不同濃度的白念珠菌懸液到對應編號的一次性營養瓊脂培養平板，用接種環涂抹均勻，置于37℃孵箱內培養。

2　結果

2.1不同濃度數量級的白念珠菌培養48 h后的生長情況培養48 h后，濃度數量級為102的白念珠菌的生長情況為：單個生長，未形成菌落，呈圓形或卵圓形，表面光滑，菌體較大，直徑為1.0～2.0 mm，見圖1a；濃度數量級為103的白念珠菌的生長情況為：多數為單個生長，少部分形成大小疏密不一的菌落，菌體直徑為1.0～2.0 mm，見圖1b；濃度數量級為104、105的白念珠菌的生長情況為：廣泛形成大片菌落，見圖1c、d。圖1c較圖1a和圖1b菌體密集且體積小，直徑為0.3～1.0 mm；圖1d較圖1c更密集、體積更小，呈針尖狀，肉眼不易觀察具體形態。

2.2不同濃度數量級的白念珠菌培養48 h后計數結果濃度數量級在102、103時，真菌數量在20～300個，可以計數；而菌液濃度數量級在104及以上時不能計數，所以菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法最理想的計數濃度。見表1。

圖1　不同濃度數量級的白念珠菌培養48 h后的生長情況

表1　不同濃度數量級的白念珠菌培養48 h后計數結果

2.3培養24、48、72 h后濃度數量級為103的白念珠菌生長情況白念珠菌在LB營養瓊脂培養平板上培養24 h后即可在肉眼下觀察到菌落，但僅是一個個針尖大小的圓形小點，具體形態不明顯，見圖2a；培養48 h后體積較培養24 h后大，大致形態可看出，呈乳白色圓形或卵圓形，表面光滑濕潤，有光澤，直徑為1.0～2.0 mm，見圖2b；培養72 h后體積較培養48 h后稍大，直徑為1.5～2.5 mm，但呈現黃色，可能與培養時間過長有關，見圖2c。

圖2　培養24、48、72 h后濃度數量級為103的白念珠菌生長情況

3　討論

白念珠菌屬于酵母屬真菌[7]，白念珠菌有其獨特的雙相（酵母相和菌絲相）生長方式[8]，真菌類鑒別培養一般采用的培養平板為沙氏培養平板。在平常的臨床工作中LB營養瓊脂培養平板培養白念珠菌較常用，該培養平板價格較便宜，配制簡單，適合真菌生長[9]。

本實驗圖1a～d表明，高濃度的白念珠菌在營養瓊脂培養平板上形成的菌落數量較多、形態偏小、呈點狀或絲狀，難以計數；低濃度的白念珠菌，在營養瓊脂培養平板上形成肉眼清晰可見的單個菌落，數量偏少，可以計數。

本實驗表明，濃度數量級在102、103時，真菌數量在20～300個時，可以計數；而菌液濃度數量級在104及以上時不能計數，所以菌液濃度為1.5×102cfu/mL時可以作為平板稀釋法最理想的計數濃度。

本實驗中，作者觀察到影響白念珠菌培養結果的因素有：在制備培養平板及培養白念珠菌時，要嚴格無菌操作，避免雜菌污染[10]；在培養期間注意按時觀察平板菌株生長狀況，做好記錄。如相機拍照，要標明時間、刻度；72 h后由于培養時間過長會有部分菌落偏黃，從而影響菌落色澤的判斷；白念珠菌稀釋濃度不同時菌體大小會出現不同，可能與各菌體營養成分不足或分布不均有關。

為了直接觀察微生物的形態及生長情況，將微生物培養在固體培養平板表面上進行形態觀察和菌落計數，已經被公認為比較精準的實驗方法。掌握白念珠菌體外培養的基本方法對于了解白念珠菌的生長周期有一定作用，對后期實驗中尋找最適接種時期、篩選菌液濃度與藥物濃度的比例有較大幫助。本實驗中所用的菌落平板稀釋法的熟練操作可為開展超聲聯合藥物對白念珠菌的損傷作用及研究超聲對其細胞壁的破壞作用的實驗研究提供支持。

[1]丁秀琴，黃曉峰．346例口腔感染者口內真菌檢出與藥敏分析[J]．中國鄉村醫藥，2014，21（5）：44-45．

[2]楊豐帥，周厚吾.白色念珠菌致病機制及治療研究進展[J].現代醫藥衛生，2013，29（22）：3411-3414.

[3]符健，賈杰，蔡篤運.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].現代預防醫學，2011，38（16）：3301-3302.

[4]于亞頡．菌種培養基滅菌技術[J]．吉林農業，2009（3）：43．

[5]崔曉燕，張宏萍，李海波．培養基的不同儲存條件對細菌檢測結果的影響[J]．上海預防醫學，2007，19（12）：631-632．

[6]蘇杭，江和遜，鄭慧敏，等．低頻低強度超聲對恥垢分枝桿菌細胞壁通透性影響的實驗研究[J]．中國超聲醫學雜志，2015，31（11）：1038-1040．

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[9]杜宗緒．3種平板計數瓊脂培養基的質量比較[J]．山西農業科學，2014，42（8）：835-837．

[10]戴瑞娣，王麗，趙向東．制備營養瓊脂培養基出現細菌污染原因分析[J]．實用醫技雜志，2004，11（20）：2105．

Comparative observation of continuous culture with different concentrations of Candida albicans*

Ye Hemin，Li Shuai，Xiang Yang，Fu Hao，Du Yonghong△
（School of Biomedical Engineering，Chongqing Medical University/Province-Ministry Co-Build State Key Lab Cultivation Base/Chongqing Key Laboratory of Ultrasound in Medicine Engineering，Chongqing 400016，China）

Objective To investigate the suitable observation concentration in the count of Candida albicans plate dilution method by comparatively observing the growth situation in different concentrations of Candida albicans in LB nutrient agar culture plate.Methods The Candida albicans stock solution was diluted to about 1.5×109cfu/mL with No.A.Then 7 sterile tubes with 20 mL were taken，each tube was added with 9 mL sterile normal saline with No.B-H.One mL of bacterial solution was absorbed from the tube A to the tube B，after mixing，1 mL of bacterial solution was absorbed again to the tube C，so did successive multiple proportion dilution to the tube H.100 μL of different concentrations of Candida albicans suspension was absorbed by pipette to the one-off agar plate with corresponding number，which was evenly coated with the inoculating loop and cultured at 37℃incubator.Results After 48 h culture，Candida albicans with the order of magnitude 104had smaller thallus with smaller volume than the order of magnitude 102，103，while 105was even more denser and smaller volume than 104，which was needle-shaped，its actual morphology was not easier to be observed by naked eye.When the orders of magnitude of Candida albicans was 102，103，the fungal counting was 20-300 and could be counted，whereas the concentration orders of magnitude reached more than 104，which could not be counted.After 24，48，72 h culture，the agar culture plate was taken out for observing.The colony could be visually observed after 24 h culture，but the actual form was not obvious.After culturing for 48 h，the volume was large than that after culturing for 24 h culture，rough morphology could be seen，milky white round or oval，smooth surface and moist，shiny，diameter of 1.0-2.0 mm.The volume after 72 h culture was slightly larger than that after 48 h culture，but the bacterial color was yellow.Conclusion The bacterial solution concentration of 1.5×102cfu/mL can be used as the suitable counting concentration of plate dilution method，culturing for 48 h is the best time to observe the colony morphology.

Candida albicans；Colony count，Microbial；In vitro；Culture media；Agar

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.005

A

1009-5519（2016）21-3272-03

重慶市基礎科學與前沿技術研究專項資助項目（csct2016jcyjA0098）；重慶醫科大學2015年國家自然科學基金預研資助項目（NSFYY201528）。

葉合敏（1994-），在讀本科生，主要從事生物醫學工程（醫療器械方向）方面的學習。

△，E-mail：duyonghong@yeah.net。

（2016-05-22）