不同苜蓿材料對木賊鐮刀菌根腐病的抗病性評價

辛寶寶, 袁慶華, 王 瑜, 馬甲強

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京 100193)

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不同苜蓿材料對木賊鐮刀菌根腐病的抗病性評價

辛寶寶, 袁慶華*, 王 瑜, 馬甲強

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所, 北京 100193)

采用土壤接菌法,對60份紫花苜蓿(Medicagosativa)種質材料進行了苗期抗根腐病性狀評價。在測定供試苜蓿材料的發病率、病情指數、株高、地上生物量和地下生物量指標的基礎上,利用隸屬函數法對其進行了抗病性綜合評價。結果表明:接種木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)后,抗鐮刀菌根腐病較強的紫花苜蓿種質材料是來自陜西乾縣的0060、美國的88-33(‘維多利亞’)、日本的85-47(‘GT49R’)和甘肅西峰的0782等;抗病性較差的材料有來自美國的88-45(‘馬里科巴’)、北京的2758(‘中苜一號’)、內蒙古準格爾的2738和拉達克的0215等;其他材料抗病性居中。

紫花苜蓿; 木賊鐮刀菌; 抗病性

紫花苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的豆科牧草,被譽為“牧草之王”。苜蓿根腐病(alfalfa root rot)是苜蓿生產上一種毀滅性的真菌土傳病害,常導致苜蓿產量大幅下降、品質降低,嚴重影響苜蓿的廣泛應用[1],成為限制苜蓿產業開發和生態建設的主要因素[2]。許多研究表明多種鐮刀菌(Fusariumspp.)可單獨或復合侵染導致苜蓿根腐病的發生,而且不同國家和地區報道的優勢鐮刀菌種類并不完全相同[3-4]。李丹[5]在對甘肅省中西部地區鐮刀菌的分類研究中發現,862個供試菌株中分離頻率最高的是木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti),占鑒定菌株總數的29.93%,是甘肅省主要優勢鐮刀菌。

木賊鐮刀菌是一種世界性的土壤真菌[6],通過入侵根部成為優勢種,以破壞維管束組織來減少和阻止根部內生真菌的聯合[7]。在植株發育的各個時期只要條件適合,均可侵染寄主,引起根腐病[8-9]。選用抗病品種是防治該病的重要措施[10]。多年來,國內外學者在評價苜蓿對根腐病的抗性方面做了大量研究[11-12], Michaud等在加拿大魁北克地區評價了14個苜蓿品種對根腐病的田間抗性及其抗性差異[13]。李敏權[14]對苜蓿根和根頸腐爛病病原菌及20份苜蓿品種的抗病性進行了研究。劉海波[15]利用病原菌毒素篩選抗根腐病苜蓿。盡管目前還沒有培育出抗根腐病的高抗品種,但品種間具有明顯的抗病差異。本研究選用國內外60份苜蓿種質材料,分別測定了其發病率、病情指數、株高、地上生物量和地下生物量,采用隸屬函數法評價接種木賊鐮刀菌后苜蓿的抗病表現，為紫花苜蓿抗根腐病種質材料的篩選提供可借鑒的指標和評價方法,同時為苜蓿抗根腐病育種、栽培提供材料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試苜蓿材料

供試苜蓿材料由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供,材料名稱及來源見表1。

1.1.2 供試菌株

供試菌株為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti),從廊坊基地苜蓿上分離獲得,純化的菌株在PDA平板上培養10 d后于4℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 接種體的制備

將保存的菌株接種于PDA培養基上,25℃恒溫培養7 d,然后在無菌條件下用手術刀輕輕刮下菌絲和分生孢子,置于裝有滅菌水的三角瓶內,充分振蕩,使孢子脫離菌絲,制成孢子濃度為1×105個/mL的懸浮液,供接種使用[2]。

稱取50 g大米45份,分別置于直徑15 cm的培養皿中,每皿加150 mL水,經蒸汽滅菌(121℃溫度下30 min)后,冷卻至室溫,然后每皿加入孢子懸浮液20 mL,與米粒混合均勻,在25℃下培養4 d。

1.2.2 育苗和接種

選取健康的紫花苜蓿種子,用0.1%升汞進行消毒,將消毒后的苜蓿種子擺放在無菌培養皿內濕潤的濾紙上,放入20℃的生長箱內發芽2 d,待幼根長到1 cm時,移到裝有滅菌土壤的花盆(高9 cm,底徑7.5 cm,口徑11 cm)中,然后放入15～25℃的溫室中培養,45 d后進行病菌接種。每盆10株,3個重復。

將制備好的木賊鐮刀菌米粒接種體放在幼苗周圍的土壤表面,然后用無菌土覆蓋,每盆接種量為每皿米粒接種體的1/4,以接種等量的無菌米粒為對照。接菌后澆足水,放在25℃溫室中培育。7 d后調查發病率。14 d后對根部進行病情分級調查,計算發病率和病情指數,并測定株高、地上及地下生物量。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 發病率及病情指數

根頸部病情分級標準參考黃寧等[10]、李敏權[16]的分級標準:0級,健康無病;1級,根頸部出現黑色斑點;2級,根頸被黑色病斑包圍;3級,根頸有縊縮現象,出現枯葉;4級,根頸嚴重縊縮,葉片全部干枯,側根減少;5級,根頸部全部腐爛,無側根,整株枯死。

1.3.2 幼苗株高的測定

株高為每盆10株苗的平均值。為了消除材料本身的誤差,用相對株高作為衡量材料對尖孢鐮刀菌抗性能力的指標。

1.3.3 地上部分生物量的測定

用剪刀沿土層割取植株地上部,用自來水沖洗干凈后放入烘箱中,105℃殺青,80℃下過夜(12 h),在干燥器中冷卻到室溫后用天平稱重(精確到0.001)。以每盆中所有植株地上部分的總干重作為材料的地上部分生物量。

相對地上生物量干重(%)=

1.3.4 地下部分生物量的測定

從已測定地上部分生物量的盆中挖取樣品,用流水沖洗直至把泥土全部沖洗干凈,放入80℃烘箱烘干24 h至恒重,冷卻至室溫稱重量(精確到0.001)。

相對地下生物量干重(%)=

1.4 抗根腐病綜合評價

抗根腐病綜合評價采用隸屬函數標準差系數賦予權重法。單項指標抗病系數計算公式如下:

單項指標的抗病性系數(%)=

運用SAS 8.0對單項指標的抗病性系數進行方差分析。

1.4.1 數據標準化

運用隸屬函數對各指標進行標準化處理。

(1)

(2)

式中,μ(X)表示隸屬函數值;Xj表示第j個綜合指標值;Xmin表示第j個綜合指標的最小值,Xmax表示第j個綜合指標的最大值,當指標與抗病性呈正相關用隸屬函數公式(1)計算隸屬函數值,當指標與抗病性呈負相關用隸屬函數公式(2)計算隸屬函數值。

1.4.2 采用標準差系數法

用公式(3)計算標準差系數Vj,歸一化后得到各指標的權重系數Wj,見公式(4)。

(3)

(4)

1.4.3 抗根腐病綜合評價

用公式(5)計算各材料的綜合評價值。

(5)

式中,D為各材料在接種木賊鐮刀菌后用綜合指標評價所得的抗病性綜合評價值。根據D對供試材料抗病性強弱進行排序。

2 結果與分析

2.1 不同苜蓿材料接種木賊鐮刀菌后的發病率和病情指數

從表1中可以看出,不同材料間對根腐病抗性存在顯著差異(P<0.05)。從發病率來看,供試材料的發病率在6.67%～86.67%之間,其中發病率在20%以下的有6份材料,發病率最低的是來自陜西長武的材料0208,發病率只有6.67%,其次是來自于秘魯的‘478572’(92-203)和來自加拿大的‘蘇普斯坦’(83-130),發病率為13.33%,而發病率達到80%的有3份材料,分別是來自美國的‘維多利亞’(88-33)、吉林的‘公農2號’(0063)和俄羅斯的‘蘇聯2號’(0731)。各材料的病情指數變化范圍在22.67～81.11之間,從中可以看出無免疫和高抗材料; 病情指數在30以下有4份材料,占總材料的6.67%,其中來自于秘魯的‘478572’(92-203)和陜西長武的0208的病情指數較低,分別為22.67和23.33,表現出對苜蓿根腐病較強的抗病性;病情指數在70以上的有7份材料,占總材料的11.67%,其中來自日本的‘GT13R’(85-48)和吉林的‘公農2號’(0063)病情指數最高均為81.11,對苜蓿根腐病表現為高感。

2.2 不同苜蓿材料接種尖孢鐮刀菌后的株高及生物量

受木賊鐮刀菌侵染后,60份紫花苜蓿材料的相對株高、相對地上生物量和相對地下生物量呈現下降趨勢,并且不同材料間存在顯著差異(P<0.05)。各材料間相對株高的變幅在3.95%～49.75%之間,相對株高≥90%的有7份材料,占總材料的11.67%,其中來自寧夏同心的2759的相對株高在95%以上;相對株高≤60%的有6份材料,占總材料的10.0%,其中來自甘肅西峰的0782和陜西的‘沂陽’(0058)相對株高最低,分別為50.25%和54.39%;大部分材料的相對株高在60%～90%之間,總共有47份材料,占總材料的78.33%。

從表1可以看出,各材料相對地上生物量的下降幅度為6.14%～81.39%之間。相對地上生物量降幅在20%以下的有8份材料,占總材料的13.33%,其中只有1份材料降幅在小于10%,是來美國的‘牧歌401+2’(2005-3),降幅為6.14%。相對地上生物量降幅高于70%的有5份材料,占總材料的8.33%,其中有2份材料高于80%,是來自美國的‘維多利亞’(88-33)和‘馬里科巴’(88-45),降幅分別為81.39%和80.95%;其他材料的相對地上生物量降幅均在20%～70%之間,總共47份材料,占總材料的78.34%。

各材料間相對地下生物量的變幅在1.02%～89.06%之間(表1),相對地下生物量降幅在10%以下的有7份材料,占總材料的11.67%,其中陜西乾縣的0060和長武的0208降幅最小,分別為1.02%和1.55%。相對地下生物量降幅在70%以上的材料有4份,占總材料的6.67%,來自美國的‘馬里科巴’(88-45)降幅最大,為89.04%;而其他49份材料的相對地下生物量降幅在40%～80%之間,占總材料的81.66%。

綜上可以得出,用同一指標分析得到的各苜蓿材料對木賊鐮刀菌的抗病性強弱程度各異;同一種質不同指標的抗病性系數并不完全一致,甚至有較大的差距。所以,用任何單一指標來評價苜蓿對木賊鐮刀菌的抗病性都存在片面性和不穩定性,必須用多個指標進行綜合評價才較為可靠。

表1 紫花苜蓿接種木賊鐮孢菌后各指標的抗性系數1)Table 1 Resistance coefficients of indices of alfalfa materials to Fusarium oxysporum after inoculation

續表1 Table 1(Continued)

材料編號Accessioncode品種名Variety來源地Origin抗性系數/% Resistancecoefficient發病率Infectionrate病情指數Diseaseindex相對株高Relativeplantheight相對地上部干重Relativeabovegroundbiomass相對地下部干重Relativeundergroundbiomass0649-法國50.0046.2263.8648.2930.430710-新疆烏魯木齊73.3367.7863.0287.1144.200731-陜西興平80.0072.7880.6977.1336.940725蘇聯2號俄羅斯63.3366.1157.7133.7835.900782-甘肅西峰76.6775.5650.2523.4197.951894-法國33.3350.7880.4280.7087.482712新疆大葉新疆56.6763.8981.2150.0052.832718甘農2號甘肅43.3354.4486.7144.4439.472736-江蘇淮陰26.6744.6775.1741.8870.072738-內蒙古準格爾36.6756.6769.6349.8119.442758中苜一號北京30.0058.8984.7327.4619.522759-寧夏同心26.6730.6796.0563.9181.882828龍牧806號黑龍江50.0057.7890.6756.2057.72F值FvalueP11.66P<0.0512.80P<0.0512.23P<0.0513.43P<0.0520.33P<0.05

1) “-”表示該材料無品種名,F值表示材料間差異顯著(P<0.05)。下同。

“-”means the germplasm materials without variety name. TheFvalue showed significant difference between different materials at the 0.05 level.The same below.

2.3 苜蓿對木賊鐮刀菌的抗病性評價

為了能夠比較全面地反映不同苜蓿種質材料對木賊鐮刀菌的抗病性,本文以發病率、病情指數、株高、地上生物量和地下生物量共5個指標為依據,采用隸屬函數法結合各指標的權重系數,綜合評價了苜蓿材料對木賊鐮刀菌的抗病性。D值代表各材料對木賊鐮刀菌的抗病性強弱,D值越大,表明其抗病性越強。由表2 可以看出,來自陜西乾縣的0060、美國的‘維多利亞’(88-33)、日本的‘GT49R’(85-47)和甘肅西峰的0782的D值較大,表明這4份材料對木賊鐮刀菌的抗病性較強。而來自美國的‘馬里科巴’(88-45)和來自北京的‘中苜一號’(2758)的D值較小,表明這些材料對木賊鐮刀菌的抗病性較弱。其他材料的抗病性居于中間。

表2 紫花苜蓿材料苗期各指標隸屬函數值與D值Table 2 Subordinate function and D value of index of the different materials in the seedling stage

續表2 Table 2(Continued)

材料編號Accessioncode品種名Variety隸屬函數Subordinatefunctionμ(1)μ(2)μ(3)μ(4)μ(5)D值Dvalue排序Order88-44PG塞特0.2920.2090.4710.7910.9190.3173188-45馬里科巴0.6670.0760.1660.0060.0000.1486089-10巴隆0.2920.4180.6990.8420.9830.3901089-12先鋒5330.4580.4090.4230.3530.3870.2764692-2034785720.0831.0000.8530.7990.7780.393994-31FRLUI10.5830.2850.6430.7910.6980.351232005-2皇冠0.7500.4280.3820.3590.2540.309332005-3牧歌401+20.4170.6750.5691.0000.6560.365170058-0.3750.4180.0900.3790.3940.259520059-0.3750.4850.6370.4620.3360.273470060-0.1670.9810.8810.6851.0000.42710062-0.5000.3990.5520.6010.8450.386130063公農2號0.9170.0000.7160.1800.5560.301380128公農1號0.5000.3800.8120.4400.4310.295400130-0.6670.2660.8680.8480.8140.39770131-0.6250.3710.4740.8440.7090.377150171-0.7920.3710.9110.6480.3030.332260208-0.0000.9720.8850.7280.9940.39380215-0.2500.2090.5250.5840.5720.233570269蘭花苜蓿0.5000.4180.2190.6010.5610.322270332-0.4580.3800.2130.2540.6430.319290425-0.5000.4280.6360.1770.2870.266500440-0.3750.6840.4980.4100.8220.379140456-0.6250.4560.2720.6130.7490.39760469-0.1670.4470.4230.6390.5740.273480470-0.5830.4470.3310.4290.3040.292410629-0.5000.4370.4770.3810.7090.360200632-0.4580.3800.5420.4700.8370.368160648普羅旺斯0.7500.2470.6410.3340.3090.280430649-0.5420.5970.2970.3940.2210.276450710-0.8330.2280.2790.9100.3780.308340731-0.9170.1430.6650.7780.2950.297390725蘇聯2號0.7080.2570.1630.2020.2830.261510782-0.8750.0950.0000.0640.9880.40241894-0.3330.5190.6590.8250.8690.388112712新疆大葉0.6250.2950.6760.4170.4760.305362718甘農2號0.4580.4560.7960.3430.3240.279442736-0.2500.6240.5440.3090.6720.319282738-0.3750.4180.4230.4150.0960.202582758中苜一號0.2920.3800.7530.1180.0970.173592759-0.2500.8631.0000.6020.8060.386122828龍牧806號0.5420.3990.8820.5000.5310.33225

3 討論與結論

本文對60份苜蓿材料接種木賊鐮刀菌后發病率、病情指數、株高、地上生物量和地下生物量5個指標的分析比較得出,苜蓿對根腐病的抗病性和其他作物一樣,不同性狀反映出的抗病性強弱程度各異,同一材料不同指標的抗病性系數并不完全一致,甚至有較大的差距[13-14]。所以,用任何單一指標來評價苜蓿對木賊鐮刀菌的抗病性都存在片面性和不穩定性,用多個指標進行綜合評價才較為可靠。因此本文采用與抗病性密切相關的指標,即發病率、病情指數、株高、地上生物量和地下生物量來作為各苜蓿材料抗病性鑒定指標。

傳統上主要根據發病率、病情指數和存活率劃分抗病等級來評價苜蓿對根腐病的抗病性強弱。在前人的研究中,由于選擇的材料范圍、指標性狀、材料份數、分析方法和劃分標準不盡相同,因此得出的結果往往不一致, Hwang等[16]和李敏權[17]根據發病率將紫花苜蓿根腐病抗性劃分為3級。郭玉霞等[18]等根據苜蓿病情指數將抗病性劃分為5級, Michaud等[15]用到了十二級病害分級標準,可比性較差。林漢明等[19]、陳德明等[20]等認為,當鑒定材料數量較多,抗逆性的指標亦較多,各指標在綜合評價時的重要性不同，且指標間又存在著一定的相關性時,供試材料對逆境反映的信息發生交叉與重疊,此時采用隸屬函數法可將各指標的抗病性系數轉換成相互獨立的綜合指標,以D值作為材料抗病性的綜合評價指標,因為D值是個[0,1]閉區間上的純數,消除了個別指標帶來的片面性,既考慮了各指標間的相互關系,又考慮到各指標的重要性,具有可比性。所以根據D值的大小就可以較準確地評價各苜蓿材料對木賊鐮刀菌的抗病性,各苜蓿材料的抗病性差異也具有可比性。該方法已在胡麻[21]、小麥[22]、花生[23]、油菜[24]等作物的抗逆性上應用,取得了比較理想的結果。

本研究采用此方法得出苜蓿材料對木賊鐮刀菌抗性較好的材料是來自陜西乾縣的0060、美國的86-33(‘維多利亞’)、日本的85-47(‘GT49R’)和甘肅西峰的0782;抗病性較弱的材料是來自美國的88-45(‘馬里科巴’)和來自北京的2758(‘中苜一號’)。

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(責任編輯：楊明麗)

Evaluation on resistance of different germplasms of alfalfa toFusariumequiseti

Xin Baobao, Yuan Qinghua, Wang Yu, Ma Jiaqiang

(Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The infection rate, disease index, plant height, aboveground biomass and underground biomass of sixty kinds of alfalfa germplasms at seedling stage were investigated after soil inoculation. The resistances of sixty alfalfa cultivars toFusariumequisetiwere comprehensively analyzed by subordinative function. The results indicated that after inoculatingF.equiseti, 0060,88-33 (‘Victoria’),85-47 (‘GT49R’) and 0782 materials were highly resistant and 88-45(‘Maricopa’), 2758(‘Zhongmu No.1’), 2738 and 0215 materials were highly susceptible, and other materials were moderately resistant.

alfalfa;Fusariumequiseti; resistance

2015-10-19

2015-12-11

農業部物種資源保護財政專項(2130135)；公益性行業(農業)科研專項(201303057)

S 435.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.028

* 通信作者 E-mail: yuanqinghua@hotmail.com