不同辣椒炭疽病菌對唑菌酯的敏感性差異

滿益龍, 譚新球, 司乃國, 陳 岳,張 卓, 劉 勇, 張德詠*

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室,湖南省農業科學院植物保護研究所, 長沙 410125; 3. 沈陽化工研究院, 沈陽 110021)

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不同辣椒炭疽病菌對唑菌酯的敏感性差異

滿益龍1,2, 譚新球2*, 司乃國3, 陳 岳2,張 卓2, 劉 勇1,2, 張德詠1,2*

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室,湖南省農業科學院植物保護研究所, 長沙 410125; 3. 沈陽化工研究院, 沈陽 110021)

辣椒炭疽病是辣椒生產上的重要病害,嚴重制約辣椒生產,唑菌酯防治辣椒炭疽病的相關研究未見報道。為此,本研究利用菌絲生長速率法測定了4種不同炭疽病菌對唑菌酯的敏感性,并對其作用靶標基因細胞色素b基因(Cytb)進行比較分析。結果表明:唑菌酯對ColletotrichumbrevisporumYYGXZ07,C.truncatumCZHP03,C.acutatumHHBY48和C.gloeosporioidesCSLL11的EC50分別為0.098、3.363、10.156和31.982 μg/mL,而且供試菌株在含藥培養基上的生長速率排序為C.truncatumCZHP03

辣椒炭疽病菌; 唑菌酯; 生物測定; 敏感性

唑菌酯是沈陽化工研究院自主創制的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑,具有殺菌活性高、抗病譜廣、環境相容性好和作用機制獨特等特點。其作用機理主要是抑制線粒體復合物Ⅲ中電子的傳遞。目前相關研究證明可有效防治黃瓜霜霉病、小麥白粉病,對水稻紋枯病菌、黃瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌、葡萄白腐病菌、蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌等也具有良好的抑菌活性。

炭疽病是危害辣椒生產的主要真菌病害,其病原菌種類較為復雜[1-3],目前我國已經報道的辣椒炭疽病菌有C.gloeosporioides[1],C.acutatum[16],C.truncatum[3],C.coccodes[14],C.boninense[2], 加上最近分離的新種C.brevisporum(本研究室分離保存,數據正在投稿中)共6個種。不同地區炭疽病菌常常混合發生,其優勢種群存在明顯差異。炭疽病菌主要危害辣椒莖稈、葉片和果實,危害嚴重時病果率達40%～60%[10],影響辣椒生產和商品價值。目前炭疽病的防治主要依賴苯醚甲環唑·嘧菌酯懸浮劑、肟菌酯·戊唑醇水分散粒劑、吡唑醚菌酯乳油等化學藥劑,但是未見利用唑菌酯防治辣椒炭疽病的報道。為此本研究采用生長速率法測定了不同辣椒炭疽病菌對唑菌酯的敏感性,在該殺菌劑應用早期建立靈敏的敏感性檢測方法及敏感性基線,對于正確評價唑菌酯對辣椒炭疽病菌的生物學活性,開展抗藥性早期監測, 及早提出藥劑的科學使用方法和抗藥性治理策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌的培養

供試辣椒炭疽病菌包括:C.gloeosporioidesCSLL11,C.acutatumHHBY48,C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07共4個種,其中設定C.gloeosporioidesCSLL11為敏感對照菌株,所有供試菌株由湖南省植物保護研究所真菌研究室提供,供試菌株保存于4℃冰箱。使用時先活化菌株, 采用PDA培養基25℃暗培養7 d,采用單孢純化備用。

1.2 供試化學藥劑

研究使用的唑菌酯原藥由沈陽化工研究院司乃國老師提供,試驗時先用丙酮將原藥溶解,然后通過滅菌水稀釋,配制成濃度為200 mg/L的母液,并利用細菌過濾器過濾,用滅菌水對濾液進行定容,現配現用。

1.3 試驗設計與處理

根據黃瓜炭疽病菌研究的相關報道[17],供試藥劑終濃度設置為0、2.5、5、10、20 、和40 mg/L 6個濃度,并分別以清水作對照,共設6個處理。每個處理重復4次。

1.4 含藥培養基制備及生長速率測定

將配制好的PDA培養基高溫滅菌,待培養基冷卻至50℃時,將濃度為200 mg/L唑菌酯母液稀釋后加到不同體積的培養基中至設定濃度,并輕輕搖勻。然后倒入直徑9 cm的培養皿中,每皿15 mL。

待培養基表面水汽蒸發后,將直徑為7 mm的病原菌菌餅置于培養基中央,于25℃恒溫培養箱中培養,從接種后第2天開始,每天采用十字交叉法測量菌落直徑,共培養8 d,直至清水對照菌絲長滿培養基為止。測量數據利用SPSS 16.0進行統計分析。

1.5 辣椒炭疽菌菌株總RNA的提取

供試菌株的總RNA提取參照Tiangen RNA simple Total RNA Kit的方法進行,并稍作修改。抽提的總RNA用新的無RNase的離心管分裝并保存在-80℃超低溫冰箱備用。

1.6 唑菌酯作用靶標基因Cytb的克隆

cDNA的合成參照Vazyme HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit進行,-20℃保存備用。通過已報道的植物炭疽病菌基因組(C.graminicolaM1.001 登錄號:XM_008101415.1、C.fioriniaePJ7 登錄號:XM_007601458.1)的Cytb基因序列分析比較,設計簡并引物CYB-F1:5′-ATGATTGCGCAGCGGGTGG-3′和CYB-R1:5′-CTACCACGCAAAGGCCARDCCRA-3′(其中R為A或G;D為G或A或T),目的片段大小約為567 bp。

以合成的cDNA為模板進行PCR擴增,PCR反應體系(25 μL)為:10×EasyTaq buffer 2.5 μL、High Pure dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μL、EasyTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1.0 μL、引物CYB-F1/ CYB-R1(10 μmol/L)各1.0 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應條件為: 94℃ 5 min；94℃ 30 s,58℃或60℃退火30 s(具體根據菌株確定),72℃45 s,共35個循環；72℃延伸10 min,4℃保存。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用TaKaRa割膠回收試劑盒回收。將獲得的目的回收產物與載體連接、轉化,具體參考pEASY?-T1 Cloning Kit進行。以通用引物M13F、M13R進行菌落PCR篩選,將篩選到的陽性克隆加入含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中,置于200 r/min 37℃搖床過夜培養。

1.7 序列分析及數據處理

序列測定由北京奧科生物公司完成。將測序結果經BLAST比對分析,以已報道的植物炭疽病菌基因組(C.graminicolaM1.001 登錄號:XM_008101415.1、C.fioriniaePJ7 登錄號:XM_007601458.1)的Cytb基因序列為參考,確定克隆序列為辣椒炭疽菌的Cytb基因序列后,利用DNAMAN version 8.0將基因核苷酸序列翻譯成氨基酸序列,利用ClustalW (http:∥www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)和BioEdit比對分析不同辣椒炭疽菌的Cytb基因差異。

2 結果與分析

2.1 不同辣椒炭疽病菌在含唑菌酯培養基上的生長速率

所有供試菌株經單孢分離純化后,采用通用引物ITS4和ITS5擴增ITS序列并測序驗證,確認正確后進行試驗。由于所有供試菌株在含藥培養基上生長速度比較緩慢，數據分析均從接種后第3天開始。不同菌株在含藥系列濃度培養基上生長速率存在一定差異。C.truncatumCZHP03對唑菌酯最為敏感,藥劑處理后菌絲生長速率明顯低于其他菌株,而且接種后第3天到第8天菌絲生長速率的波動較小;C.gloeosporioidesCSLL11的菌絲生長速率明顯高于其他菌株,接種后第4天到第8天,生長速率逐漸下降;C.brevisporumYYGXZ07和C.acutatumHHBY48 菌絲生長相對比較穩定(圖1a～d)。其生長速率順序為C.truncatumCZHP03

圖1 不同辣椒炭疽病菌在含唑菌酯培養基上的生長速率Fig.1 The mycelial growth rate of different Colletotrichum strains causing anthracnose of Capsicum annuum plants on the medium with different concentrations of pyraoxystrobin

2.2 不同辣椒炭疽病菌對唑菌酯的敏感性

根據菌絲生長速率法測定抑制率,利用SPSS 16.0進行線性回歸分析,唑菌酯對C.brevisporumYYGXZ07的抑制作用最強,其EC50為0.098 μg/mL。而對C.gloeosporioidesCSLL11的EC50為31.982 μg/mL,是C.brevisporumYYGXZ07的327倍。供試菌株EC50的順序為C.brevisporumYYGXZ07

表1 不同辣椒炭疽病菌菌株對唑菌酯的敏感性Table 1 Sensitivity of different Colletotrichum strains to pyraoxystrobin

2.3 辣椒炭疽病菌唑菌酯靶標基因Cytb的比較與分析

從表1可以看出,唑菌酯對不同菌株的EC50存在明顯差異,而且相關研究表明炭疽病菌對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(嘧菌酯)極易產生抗藥性[13]。為進一步弄清不同菌株對唑菌酯的敏感性差異,對唑菌酯靶標基因Cytb進行了克隆(圖2a),并進行了序列分析。結果表明:供試菌株C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03、C.brevisporumYYGXZ07和C.gloeosporioidesCSLL11與C.fioriniaePJ7 (GenBank 登錄號:XM_007601458.1)的Cytb基因氨基酸序列的同源性分別為100%、83.51%、85.64%和82.98%,而與C.graminicolaM1.001 (GenBank 登錄號:XM_008101415.1)的同源性分別為87.23%、83.51%、86.17%和82.45%。C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07與C.gloeosporioidesCSLL11的Cytb氨基酸序列同源性分別為82.98%、88.30%和87.77%(圖2b)。通過BioEidt比對分析,結合不同辣椒炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性反應[11],發現氨基酸29～31位、63位、93位、124～126位、130位和180位C.gloeosporioidesCSLL11分別為AVV、H、P、AAA、L和P;其中氨基酸29～31位和180位C.acutatumHHBY48分別為IVA和A,而C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07均分別為VVA和S,124～126位C.acutatumHHBY48、C.truncatumCZHP03和C.brevisporumYYGXZ07均為GAL。推測以上位點氨基酸可能與菌株對唑菌酯的敏感性差異存在一定關聯(圖3)。

圖2 4種辣椒炭疽病菌Cytb基因的克隆(a)和系統進化分析(b)Fig.2 PCR products of Cytb genes from Colletotrichum truncatum CZHP03, C.gloeosporioides CSLL11, C.acutatum HHBY48 and C.brevisporum YYGXZ07 (a) and their phylogenetic tree based on Cytb amino acids sequence(b) by ClustalW methods

圖3 4種辣椒炭疽病菌Cytb基因氨基酸序列比對分析Fig.3 Analysis of Cytb amino acids sequence from Colletotrichum acutatum HHBY48, C.brevisporum YYGXZ07, C.truncatum CZHP03 and C.gloeosporioides CSLL11 by BioEidt methods

3 討論

在我國,辣椒年種植面積超過130萬hm2,但是炭疽病菌等病蟲害的脅迫[1,3]給辣椒生產帶來巨大壓力。除了報道的C.gloeosporioides,近年來國際學者根據C.truncatum和C.capsici的形態特征和分子生物學鑒定方法,將二者合并為C.truncatum,另外一些危害辣椒的炭疽病菌新種也相繼發現,如四川德陽的C.boninense[2]和湖南岳陽的C.brevisporum(投稿中),表明我國辣椒炭疽病菌種群田間存在復雜多樣性。另外, Diao Yongzhao等利用衛星DNA標記分析我國13個辣椒種植區C.truncatum的遺傳多樣性,發現C.truncatum存在有性重組和地域分布[3],我們針對湖南湘中、湘東、湘南和湘西等地區C.gloeosporioides進行分析也發現同樣的結果(未發表)。表明辣椒炭疽病田間管理有必要制定分區管理策略。

辣椒炭疽病防治主要有抗病品種、生物防治和化學防治[5-9]。目前化學防治仍然是主要的防治方法,而且主要依靠以甲氧基丙烯酸酯類為主的化學農藥[10],但是田間防治效果存在較大波動,除了環境因素不同外,很大程度上歸結于田間炭疽病種類復雜,如湖南長沙主要以C.gloeosporioides為優勢種群、而湖南岳陽主要以C.brevisporum為優勢種群、湖南湘西地區則以C.acutatum為優勢種群、湘南地區則以C.truncatum為優勢種群(數據未發表),本研究證實了不同炭疽病菌對農藥的敏感性存在顯著差異,這與不同辣椒炭疽病菌對嘧菌酯的敏感性差異一致[11];而且通過唑菌酯對炭疽病菌的作用靶標基因Cytb進行克隆和分析,推測其中一些位點的變異與菌株對唑菌酯的敏感性存在一定的關聯,相關位點的確認工作正在進行中。為此要合理高效使用化學農藥,需要根據當地辣椒炭疽病菌種類和優勢種群組成,建立分區指導用藥防治對策,減少化學農藥的投入,保障辣椒安全生產。

辣椒炭疽病菌對甲氧基丙烯酸酯類(嘧菌酯)敏感性研究表明,其具有獨特的作用機制,與已有的所有殺菌劑無交互抗藥性。但已有研究表明多種植物病原真菌對該類藥劑產生抗藥性自發突變頻率較高,在高選擇壓下自然界易形成抗藥性病原真菌群體[11-13]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑因為作用位點單一,長期頻繁使用極易產生抗藥性,而且相關研究報道證明在包括蘋果、黃瓜等許多作物上檢測到甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗性病原菌,導致對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑產生抗藥性的直接原因是病原菌細胞色素b上的氨基酸殘基被取代,以致影響藥劑與靶點的結合[13],主要是127～147 位和256～296 位氨基酸系列區內的氨基酸殘基發生了單點取代突變,其中,在127～147位區域的取代大多表現較高的抗性水平,最強而且頻次最高的突變發生在143 位點,該位點的氨基酸由甘氨酸變成了丙氨酸，形成G143A 突變體[4]。而我們的研究中4個供試菌株中C.gloeosporioides的靶標基因Cytb的124～126位為AAA,其他3菌株該位點為GAL,與上述報道結果一致。而且在我們的室內加壓選擇中,發現C.gloeosporioides和C.acutatum在加壓選擇6代后,菌株產生了明顯的抗藥性,EC50值是出發菌株的5～10倍(未發表)。唑菌酯是近年沈陽化工研究院自主創新開發的用于防治炭疽病及其他病害的新型殺菌劑,目前在辣椒炭疽病防治方面未見報道,為此在該殺菌劑應用早期建立靈敏的敏感性檢測方法及敏感性基線,對于正確評價唑菌酯對辣椒炭疽病菌的生物學活性,開展抗藥性早期監測,及早提出藥劑的科學使用方法和抗藥性治理策略具有重要意義。

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(責任編輯：楊明麗)

Sensitivity differentiation of differentColletotrichumspp. strains causing anthracnose ofCapsicumannuumL.plants to pyraoxystrobin

Man Yilong1,2, Tan Xinqiu2, Si Naiguo3, Chen Yue2, Zhang Zhuo2, Liu Yong1,2, Zhang Deyong1,2

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Province Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops,Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China;3. Shenyang Research Institute of Chemical Industry, Shenyang 110021, China)

The anthracnose disease caused byColletotrichumspp. is an important limited factor in pepper production in the world. Many chemicals have been used to control this disease in the fields. However, so far, pyraoxystrobin, a new strobilurin fungicide, hasn’t been reported in the disease control. Therefore, sensitivities of four differentColletotrichumstrains to pyraoxystrobin were determined through bioassay of mycelial growth rate, and target gene of pyraoxystrobin, cytochrome b (Cytb) of differentColletotrichumspecies was cloned and analyzed in this study. The results showed that the EC50value of pyraoxystrobin toC.brevisporumYYGXZ07,C.truncatumCZHP03,C.acutatumHHBY48 andC.gloeosporioidesCSLL11 was 0.098,3.363,10.156 and 31.982 μg/mL,respectively. The mycelial growth rate was ranked asC.truncatumCZHP03

Colletotrichumspp.; pyraoxystrobin; bioassay; sensitivity

2016-03-06

2016-07-06

國家自然科學基金(31471831); “十二五”國家科技支撐計劃(2014BAD05B04-4)

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.030

* 通信作者 E-mail：tanxinqiu2008@163.com；dyzhang78@163.com