湖南省草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的抗藥性檢測

張 亞, 王 翀, 劉雙清, 廖曉蘭,3*, 馬文月

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室, 長沙 410128;3. 湖南省生物農藥與農藥制劑加工工程技術研究中心,長沙 410128; 4. 湖南農業大學理學院, 長沙 410128)

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湖南省草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的抗藥性檢測

張 亞1,2, 王 翀4, 劉雙清1, 廖曉蘭1,2,3*, 馬文月1

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128; 2. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室, 長沙 410128;3. 湖南省生物農藥與農藥制劑加工工程技術研究中心,長沙 410128; 4. 湖南農業大學理學院, 長沙 410128)

為明確湖南省草莓灰霉病菌菌株的抗藥性狀況,2013-2015年從湖南省不同地區草莓灰霉病病果或病葉上經單孢分離獲得草莓灰霉病菌454株,采用最小抑制濃度法(MIC)檢測不同地區草莓灰霉病菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗藥性。結果表明:草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗性頻率分別為55.73%,77.31%、3.52%和77.31%;所測菌株對4種殺菌劑的敏感性類型有CbzRPcmRIpdRPmtR、CbzSPcmRIpdRPmtR、CbzRPcmRIpdSPmtR、CbzSPcmRIpdSPmtS、CbzRPcmSIpdSPmtR、CbzSPcmRIpdSPmtR等6種,其所占比例分別為33.26%、5.07%、41.41%、4.63%、3.96%、11.67%，未發現對4種殺菌劑均敏感的類型,表明湖南省草莓灰霉病菌已對多菌靈、腐霉利和嘧霉胺產生抗藥性,對異菌脲的抗藥性較低。

草莓; 灰霉病菌; 殺菌劑; 抗藥性

草莓味道鮮美,營養豐富,是重要的水果。草莓在生長的過程中常受到各種因素的干擾,如:氣候條件、地理環境、種植制度、各種病蟲害等,其中病害是影響草莓產量和品質的重要因素。草莓灰霉病是草莓開花至結果期發生最嚴重的病害,每年引起的經濟損失達10%～30%,嚴重的達89%[1]。迄今為止,尚未發現對草莓灰霉病高抗的品種[2-3]。為有效控制草莓灰霉病的發生,采用化學藥劑防治是最有效的手段[4]。目前,生產上主要使用的化學藥劑有苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利和異菌脲、苯氨基嘧啶類殺菌劑嘧霉胺等。由于草莓灰霉病菌遺傳變異頻繁、適合度高、生長快,連續使用同一種化學藥劑,極易使其對殺菌劑產生抗藥性[5]。國內許多研究已經證實草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、乙霉威、異菌脲等多種化學藥劑產生了抗藥性[6-9]。法國、希臘等國家也有關于草莓灰霉病菌對一些農藥產生抗藥性的報道[10-11]。在中國,已有一些地區,如遼寧、河北、河南、山東、江蘇、浙江等,報道過草莓灰霉病菌具有抗藥性，還有一些草莓種植區一直未見灰霉病菌抗藥性的報道[12-17]。湖南作為草莓生產的重要基地,近十年來種植面積逐年擴大,但湖南位于長江以南,氣候特征與長江以北各省顯著不同,尤其在草莓開花結果期,陰雨連綿,低溫高濕的氣候給草莓灰霉病的發生和流行創造了條件,加速了草莓灰霉病的發生。本課題組前期調查了湖南省不同地區草莓灰霉病的發生和防治情況,發現湖南各地區草莓灰霉病的發病率較高,部分地區病情嚴重,甚至絕收[18]。為減少草莓灰霉病帶來的損失,保障草莓的安全生產,湖南各地普遍使用多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺來控制草莓灰霉病的發生,不少地區用藥史超過20年,但有關湖南省草莓灰霉病菌抗藥性研究一直未見報道。本課題組在前期研究的基礎上,進一步明確了湖南省草莓灰霉病對4種農藥的抗藥性、抗藥頻率以及敏感性類型等,旨在為制定防治草莓灰霉病的新方案或措施,以及指導合理用藥提供決策依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

2013-2015年2-5月分別從湖南的湘南(郴州、永州、衡陽)、湘中(長沙、瀏陽)、湘北(常德、岳陽)、湘西(張家界、邵陽)、湘東(湘潭、株洲)等24個地區采集草莓灰霉病樣,并進行純化獲得純度較高的灰霉病菌菌株(表1)。

1.1.2 供試藥劑

蔗糖,購自國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂,購自福建省泉州市泉港化工廠;97%多菌靈原藥(carbendazim),由天津希恩思生化科技有限公司生產,用微量0.1 mol/L鹽酸溶解后,無菌水稀釋配成母液;98%腐霉利原藥(procymidone),由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產,用微量丙酮溶解后,無菌水稀釋配成母液;97%異菌脲原藥(iprodione),由天津希恩思生化科技有限公司生產,用微量丙酮溶解后,無菌水稀釋配成母液;97%嘧霉胺原藥(pyrimethanil),由上海畢得醫藥科技有限公司生產,用微量丙酮溶解后,無菌水稀釋配成母液。

表1 供試草莓灰霉病菌菌株及其來源Table 1 Isolates and sources of Botrytis cinerea in this study

1.1.3 供試儀器及常用器皿

SW-CJ-1B超凈工作臺,由蘇州尚田潔凈技術有限公司生產;SYQ-DSX-280B滅菌鍋,由上海申安醫療器械廠生產;MJP-250培養箱,由上海森信實驗儀器有限公司生產;BCD-539WT冰箱,由青島海爾股份有限公司生產;ME204G電子天平,由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司生產;鑷子、挑針、打孔器、接種環、電爐、三角瓶、容量瓶、棕色廣口瓶、封口膜、直尺等為實驗室常用耗材。

1.2 方法

1.2.1 PSA培養基的制備

將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200 g并切成小方塊,加水煮沸20～30 min,至能被玻璃棒戳破即可,用四層紗布過濾,加熱,根據實際試驗需要加17～20 g瓊脂,繼續加熱攪拌混勻,待瓊脂溶解完全后,加入蔗糖,攪拌均勻,稍冷卻后再補足水分至1 000 mL,分裝三角瓶,加塞、包扎,置于滅菌鍋中濕熱滅菌(121℃)20 min,冷卻后貯存備用[19]。

1.2.2 病樣的采集與分離

采用單孢分離法分離病菌。把采集的典型病樣(病果或病葉)置于解剖鏡下,尋找目標孢子,最初先在低倍鏡下(4×10)尋找,再在高倍鏡下(40×10)觀察是否為單孢子。找到單個孢子后,將挑孢針在酒精燈上高溫滅菌,稍待冷卻,用挑孢針把孢子粘上,在酒精燈火焰上方移入試管PSA斜面培養基上,標上記號,置于20～23℃恒溫培養箱中暗培養24～48 h,待長出純菌落,放入4℃冰箱備用[20]。

1.2.3 草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗藥性測定

采用最低抑制濃度法(MIC) 檢測草霉灰霉病菌對各藥劑的抗藥性[21]。參考周明國等[21]、韓巨才等[22]、禮茜等[17]、陳仁等[23]的方法并做適當的修改,設置多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的鑒別濃度為:5.0 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、1.0 μg/mL。于PSA培養基約45℃時加入各藥劑,分別制成含藥平板,將待檢測的灰霉病菌接在PSA平板上培養3 d后取直徑為5 mm的菌餅移至各含藥平板上,置于22℃培養箱中連續培養3 d,觀察生長情況,不能在各藥劑的鑒別濃度下生長的為敏感菌株,能生長的為抗性菌株,計算各地敏感和抗性菌株的發生頻率。

1.2.4 數據分析

采用Excel軟件分析采集的相關數據。

2 結果與分析

2.1 湖南省草莓灰霉病菌抗性頻率及分布

通過單孢分離法共從湖南省不同地區分離得到草莓灰霉病菌454株,其中湘南99株,湘中184株,湘東47株,湘北77株,湘西47株。采用最小抑制濃度法(MIC)測定各菌株對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗藥性。結果表明,多菌靈敏感菌株201株,抗性菌株253株;腐霉利敏感菌株103株,抗性菌株351株;異菌脲敏感菌株438株,抗性菌株16株;嘧霉胺敏感菌株103株,抗性菌株351株;湖南省草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗性頻率平均值分別為55.73%,77.31%、3.52%、77.31%(表2),其中對腐霉利和嘧霉胺的抗藥性最強,多菌靈次之,對異菌脲的抗藥性較低。分析湖南各地情況,湘中和湘北地區草莓灰霉病菌的抗藥性最強,其對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺的抗性頻率分別為52.71%、85.33%、2.17%、70.65%,85.71%、55.36%、1.79%、83.93%(表2);湘西和湘東地區草莓灰霉病菌抗藥性次之,湘南地區的抗藥性最弱。說明在湖南省施用腐霉利和嘧霉胺防控草莓灰霉病的效果不佳,多菌靈也不理想,施用異菌脲可能有一定的效果,建議混用或輪用作用機制不同的農藥,提高防病效果。

2.2 湖南省草莓灰霉病菌敏感性類型

由表3可知,根據抗、感程度不同,可將從湖南省不同地區分離的454株草莓灰霉病菌分為CbzRPcmRIpdRPmtR(對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺均表現抗性)、CbzSPcmRIpdRPmtR(對多菌靈表現敏感,對腐霉利、異菌脲、嘧霉胺表現抗性)、CbzRPcmRIpdSPmtR(對多菌靈、腐霉利、嘧霉胺表現抗性,對異菌脲表現敏感)、CbzSPcmRIpdSPmtS(對多菌靈、異菌脲和嘧霉胺表現敏感,對腐霉利表現抗性)、CbzRPcmSIpdSPmtR(對多菌靈和嘧霉胺表現抗性,對腐霉利和異菌脲表現敏感)、CbzSPcmRIpdSPmtR(對多菌靈和異菌脲表現敏感,對腐霉利和嘧霉胺表現抗性)6種類型,其中CbzRPcmRIpdSPmtR類型的菌有188株,所占比例為41.41%,CbzRPcmRIpdRPmtR類型的菌有151株,占33.26%,CbzSPcmRIpdSPmtR類型的有53株,占11.67%,其他敏感性類型按照所占比例從大到小依次為CbzSPcmRIpdRPmtR>CbzSPcmRIpdSPmtS>CbzRPcmSIpdSPmtR,未發現對4種殺菌劑均敏感的類型。說明湖南省不同地區草莓灰霉病菌的抗藥性以CbzRPcmRIpdSPmtR為主,不同地區在防治草莓灰霉病時,連續施用多菌靈、腐霉利、嘧霉胺,導致草莓灰霉病菌對這3種藥劑產生抗藥性。異菌脲對草莓灰霉病菌的防控效果較好,可以與生產上其他藥劑混用或輪用,但不可與腐霉利混用,以免失效。另外,在被檢測的菌株中,未發現對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺全部都敏感的菌株,這進一步說明湖南省各地草莓灰霉病菌對4種藥劑已普遍產生抗藥性,同時,也說明不同地區莓農存在用藥不規范情況,如:單一使用藥劑,隨意增加用藥量,濫用或亂用藥劑等,這無形中增大了防治的難度,因此,生產上,應堅持科學混用或輪用,或使用新藥劑,延緩病菌產生抗藥性,才能有效提高防病效果。

表2 草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的抗藥性Table 2 Resistance of Botrytis cinerea from strawberry to four fungicides

表3 草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的敏感性類型1)Table 3 Susceptibility types of Botrytis cinereafrom strawberry to four fungicides

1) 多菌靈:Cbz; 腐霉利:Pcm; 異菌脲:Ipd; 嘧霉胺:Pmt; 抗性:R; 敏感:S。

Carbendazim: Cbz; Procymidone: Pcm; Iprodione: Ipd; Pyrimethanil: Pmt; Resistant: R; Susceptible: S.

3 結論與討論

3.1 草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的抗藥性

本研究表明，湖南省草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、嘧霉胺已產生抗藥性，其抗性頻率分別為55.73%、77.31%、77.31%，如果單獨施用這3種藥劑控制草莓灰霉病將達不到應有的效果。草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率較低(3.52%)，繼續施用還可有一定的防效。由于灰霉病菌具有繁殖速度快、變異性大，適應能力強的特點，盲目增加用藥量和用藥次數，極易誘發病原菌產生抗藥性。周明國等[21]最早發現江蘇省草莓灰霉病菌對多菌靈產生了抗性，其抗性頻率為37.69%。潘以樓等[16]2013年的研究結果顯示江蘇省草莓灰霉病菌對多菌靈和異菌脲的抗性比湖南高，其抗性頻率分別為67.5%和63.6%，但對腐霉利的抗性比湖南低，其抗性頻率僅為11.2%。劉圣明等[14]認為河南省番茄灰霉病菌對多菌靈和腐霉利的抗藥頻率為81.29%和80.58%，明顯高于湖南省草莓灰霉病菌對這兩種藥劑的抗性頻率，這可能跟不同省份的用藥史和用藥水平不同有關。禮茜等[17]發現浙江省建德市草莓灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率達17.5%，顯著高于湖南地區。宋晰等[24]的研究表明，內蒙古和遼寧的灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率超過90%，顯著高于其他省份。韓巨才等[22]研究了山西省灰霉病菌對多菌靈和腐霉利的抗藥性，發現晉南地區抗藥性較高。紀明山等[12]研究了遼寧省各地番茄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性，結果表明灰霉病菌對嘧霉胺存在抗藥性，抗性頻率為20%。張瑋等[25]研究了國內不同省份葡萄灰霉病菌對嘧霉胺的抗藥性，結果發現各地區的葡萄灰霉病菌對嘧霉胺均存在抗性，而且抗性頻率最高可達44.23%，建議限制其使用，或者輪用，以減緩抗藥性。劉超等[15]研究了山東省各地灰霉病菌對腐霉利的抗藥性，結果表明山東省各地灰霉病菌的抗性頻率為67.69%，但只發現了中、低抗菌株，未發現高抗菌株。綜上所述，我國草莓灰霉病菌抗藥性的產生與各地地理特征有一定的相關性，但無必然性，不論從北到南，還是從西到東，隨著緯度和地勢的降低，溫濕條件更有利于病害的發生。不科學用藥導致病菌普遍產生抗藥性。

3.2 草莓灰霉病菌對4種殺菌劑敏感性類型

本研究發現，湖南省草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲和嘧霉胺的敏感性類型有6種，分別為CbzRPcmRIpdRPmtR、CbzSPcmRIpdRPmtR、CbzRPcmRIpdSPmtR、CbzSPcmRIpdSPmtS、CbzRPcmSIpdSPmtR、CbzSPcmRIpdSPmtR，其中以CbzRPcmRIpdSPmtR類型為主，所占比例為41.41%，未發現對4種藥劑都敏感的菌株，說明湖南省草莓灰霉病菌對4種藥劑已普遍產生了抗藥性。由于我國各地地理特征、環境條件、農民的安全意識水平不同，在科學用藥方面差異很大，不同地區的灰霉病菌對不同藥劑的敏感類型也不同。劉圣明[14]等研究了河南地區番茄灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、乙霉威的抗性，發現共有6種表現型，其中以BenRDicRNPCR類型為主，所占比例為71.22%。喬廣行等[26]認為北京地區的灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威的抗性表現類型共有4種，以BenRDicRNPCR類型為主，所占比例為56.22%。潘以樓等[16]認為江蘇地區草莓灰霉病菌對腐霉利、多菌靈、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺5種藥劑的敏感性類型主要有17種，其中對多菌靈、異菌脲、嘧霉胺表現抗藥性及對腐霉利、乙霉威表現敏感的菌株共有63個，所占比例為30.6%，而且敏感性類型明顯比河南、湖南、福建地區豐富。不同地區敏感性類型不同，說明各地在用藥歷史，用藥水平、施藥方法、氣候特征、栽培條件等存在差異。而各地敏感性類型的多少常跟被測試藥劑多少有關。目前，各地檢測的敏感性類型在6～20種之間，有些藥劑在生產上應用了很久，但未被檢測，而且全國范圍內的敏感性類型屬于哪種，還有待今后深入研究。

通過本研究結果可知，湖南省草莓灰霉病菌已對多菌靈、腐霉利、嘧霉胺產生抗性，但其抗性分子機制尚不清楚，需要今后重點研究。

3.3 草莓灰霉病菌對殺菌劑的交互抗性

植物病原菌對一種農藥產生抗藥性后，對另外一種或幾種作用機理相同或類似的農藥也產生抗性稱為交互抗性。有研究證實腐霉利和異菌脲存在交互抗性[17]，而本研究檢測的454株草莓灰霉病菌對腐霉利的抗性頻率為77.31%，高于50%；對異菌脲的抗性頻率僅為3.52%，遠遠低于20%，抗藥性較弱，并不完全表現交互抗性。本研究的結果與潘以樓等[16]的結果一致。這兩種藥劑的作用機制有待進一步探討。另外，病菌產生交互抗性后衍生的一些問題，如除輪用或混用外，如何減弱交互抗藥性，如何恢復病菌的敏感性等也是未來研究的重要課題。

3.4 草莓灰霉病菌對4種殺菌劑的多重抗藥性

關于草莓灰霉病菌對腐霉利、多菌靈、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺等藥劑存在單抗的研究較多[6-9]，對腐霉利和多菌靈、異菌脲和多菌靈、乙霉威和多菌靈等藥劑存在雙抗的報道也有不少[22,27-28]，但是草莓灰霉病菌對多種藥劑的多抗性研究的報道還較少。本研究結果表明，草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利、異菌脲、嘧霉胺都產生抗藥性的菌株為151株，占所測菌株的33.26%，三重抗性菌株211株，占所測菌株的46.48%，雙抗菌株71株，占所測菌株的15.63%，單抗菌株21株，占所測菌株的4.63%。潘以樓等[16]研究了江蘇地區草莓灰霉病菌對5種殺菌劑的抗藥性，發現該地區存在對多菌靈、腐霉利、異菌脲和嘧霉胺同時具有抗性的菌株，但所占比例較低，而對5種藥劑中3種或2種同時具有抗性的菌株所占比例較大，單抗菌株所占的比例相對較少。江蘇和湖南同在長江流域，在草莓開花結果期，低溫高濕病害發生相對較重，而莓農急于控制病害，會頻繁施藥進行防治，由于使用的殺菌劑類型較多，致使菌株產生多重抗藥性。

我國有關草莓灰霉病菌多抗性的研究還不系統，雖然已進行了一些相關研究，但還存在不少問題，如：缺少單抗或多抗的檢測技術規范；一些地區，如新疆、青海、西藏、云南等是否存在抗藥性菌株尚缺乏權威性報道，有待今后進一步調查研究。

3.5 草莓灰霉病菌新殺菌劑的篩選

近年來，不少地區報道采用常規藥劑防治草莓灰霉病的效果不理想或者無效。草莓灰霉病菌產生抗藥性是導致防效下降的主要原因之一。河南地區灰霉病菌已對多菌靈、腐霉利、乙霉威產生了三重抗性[14]。江蘇地區草莓灰霉病菌對腐霉利、多菌靈、乙霉威、異菌脲、嘧霉胺5種常用藥劑產生了多重抗性[16]。為及時解決這一問題，不少研究機構開始著手研制新的藥劑，如：氟啶胺、咯菌腈、啶酰菌胺、嘧菌環胺、丙烷脒，以及一些微生物次生代謝產物(包括抗菌蛋白、抗菌肽、抗生素、生物堿等)和植物源代謝產物(包括植物精油等)等[29-34]。然而這些新藥劑在應用時仍有一些問題值得探討：①新藥劑和老藥劑之間是否存在交互抗性或負交互抗性；②病菌本身的抗性頻率及其突變體的適合度；③病菌對新藥劑的敏感性。在生產上，應堅持將作用機理不同的藥劑輪用或交替使用，以提高對草莓灰霉病的防治效果。

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(責任編輯：楊明麗)

Detection of the resistance ofBotrytiscinereaon strawberry in Hunan Province to four fungicides

Zhang Ya1,2, Wang Chong4, Liu Shuangqing1, Liao Xiaolan1,2,3, Ma Wenyue1

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha 410128, China; 3. Hunan Biological Pesticides and Pesticide Preparation Processing Engineering Technology Research Center, Changsha 410128, China; 4. Science College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

To investigate the resistance ofBotrytiscinereato carbendazim, procymidone, iprodione and pyrimethanil, 454 strains ofB.cinereawere collected from the diseased strawberry fruits or leaves in different regions of Hunan Province in 2013-2015 and resistance to the four fungicides were detected by minimal inhibitory concentration (MIC) method. The results showed that the resistance frequency of carbendazim, procymidone iprodione and pyrimethanil was 55.73%,77.31%, 3.52% and 77.31%, respectively. The susceptibility types were CbzRPcmRIpdRPmtR, CbzSPcmRIpdRPmtR, CbzRPcmRIpdSPmtR, CbzSPcmRIpdSPmtS, CbzRPcmSIpdSPmtR, CbzSPcmRIpdSPmtR, accounting for 33.26%, 5.07%, 41.41%, 4.63%, 3.96% and 11.67%, respectively. There was no type to be found that showed susceptible to all four fungicides. The results suggest thatB.cinereaon strawberry plants in Hunan has produced resistance to carbendazim, procymidone and pyrimethanil,but susceptible to iprodione. Therefore, it is urgent to apply new fungicide or alternate fungicide with different mechanism to controlB.cinerea.

strawberry;Botrytiscinerea; fungicide; resistance

2015-09-09

2015-11-05

公益性行業(農業)科研專項(201303025)

S 436.68

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.032

* 通信作者 E-mail:lxllxl423@163.com