姜黃素煙酸酯對血管平滑肌細胞增殖及ERK1/2信號通路的影響

楊冬梅，陽 巍，邱 飛，孫四玉，陳劍雄，張彩平， 熊國祚， 庹勤慧，4， 廖端芳,

(1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2. 南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；3. 湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治重點實驗室，湖南 長沙 410208；4. 湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208)

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姜黃素煙酸酯對血管平滑肌細胞增殖及ERK1/2信號通路的影響

楊冬梅1，陽 巍2，邱 飛1，孫四玉1，陳劍雄3，張彩平2， 熊國祚2， 庹勤慧2，4， 廖端芳1,2

(1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2. 南華大學藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；3. 湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治重點實驗室，湖南 長沙 410208；4. 湖南中醫藥大學醫學院，湖南 長沙 410208)

目的 探討姜黃素煙酸酯(curcumin trinicotinate，CurTn)對血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖的影響及其可能機制。方法 體外培養VSMC，體積分數為0.1的FBS刺激VSMC生長。MTT法觀察CurTn對VSMC活力的影響；流式細胞術分析細胞周期；Western blot檢測PCNA、p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達。結果 CurTn抑制VSMC增殖并呈現一定量效、時效關系，并且使G1期的細胞比例增加，S期細胞比例下降，PCNA蛋白表達下調。同時發現CurTn能明顯抑制p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達。結論 CurTn能明顯抑制VSMC增殖，其作用機制可能與p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達下調有關。

姜黃素煙酸酯；煙酸；姜黃素；VSMC；增殖；ERK；機制

心血管疾病是一種嚴重威脅人類健康，特別是中老年人健康的常見病。我國每年近300萬人死于心血管疾病，占全部死亡原因的40%，居各種死因之首[1-2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的主要發病原因，它是一種多因素導致的動脈血管病變，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖是AS形成的關鍵環節[3]。因此，抑制VSMC的異常增殖能夠抑制血管壁肥厚，延緩動脈硬化，從而防治多種心腦血管疾病。

姜黃素(curcumin)是大部分姜科植物都含有的一種重要活性成分。研究已證實[4]，姜黃素具有抑制平滑肌細胞增殖，延緩AS發生發展的作用，但是生物利用度低限制了其臨床應用。煙酸又稱維生素B3，文獻報道其具有明顯抗AS的作用，這可能與它作用于AS病變中的細胞增殖和遷移有關[5]。但單用煙酸能引起皮膚潮紅、瘙癢、胃腸道刺激等副作用。為充分發揮姜黃素和煙酸的藥物療效，克服各自缺點，實驗室根據新藥設計的拼合原理，合成了具有自主知識產權的新型合成化合物姜黃素煙酸酯(curcumin trinicotinate，CurTn)(專利號：ZL20091 0042665.8)。前期體內實驗研究已發現姜黃素煙酸酯具有抗AS作用，但機制尚未清楚。本研究擬建立血清刺激的VSMC增殖模型，觀察CurTn對體外培養VSMC增殖的影響，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 姜黃素煙酸酯由南華大學藥理植化室合成(純度為95%以上)，使用前用DMSO溶解，用DMEM培養基稀釋成所需濃度于4℃儲存備用。

1.2 試劑與儀器 VSMC細胞株購于長沙湘雅中心實驗室；姜黃素和煙酸購于上海阿拉丁試劑；胎牛血清(FBS)、DMEM購于美國Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(MTT)、PD98059購于美國Sigma公司；一抗PCNA、CyclinD1、二抗山羊抗兔IgG購于美國Santa Cruz公司；一抗p-ERK1/2購于美國Cell Signaling公司；一抗β-actin、二抗山羊抗小鼠購于武漢博士得公司；一抗α-tubulin購于北京博奧森公司；ECL試劑盒購于碧云天；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 細胞培養使用含體積分數為0.1的FBS的DMEM培養基，細胞同步化使用含體積分數為0.001的FBS的DMEM培養基，并置于37℃、5%的CO2、飽和濕度的培養箱中進行培養。

1.3.2 MTT法檢測細胞活力 取對數期VSMC，消化吹打成5×107·L-1的密度，每孔200 μL接種于96孔板中。待細胞貼壁后，用含體積分數為0.001的FBS的培養基同步化處理24 h。然后按不同組別的處理因素處理VSMC，同時設置調零孔(不加細胞和處理因素，加MTT和DMSO)，周邊孔則加入200 μL的PBS避免邊緣化效應。24 h后，每孔加MTT液15 μL，繼續孵育4 h。隨后吸出每孔的培養液，加入200 μL的DMSO，搖床上震搖10 min，570 nm波長處檢測OD值。

1.3.3 流式細胞術分析細胞周期 VSMC適量接種于100 mm培養皿中，待細胞融合度達到60%～80%后，同步化處理24 h。接著按不同處理因素處理，24 h后，消化細胞，并收集于離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，倒掉培養基，加入1～2 mL PBS，再次離心5min，倒掉PBS，用流式固定液[V(乙醇) ∶V(冰PBS) = 4 ∶1]，4℃固定過夜，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.3.4 Western blot檢測相關蛋白表達 取生長狀態良好的各組細胞，用預冷的PBS洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF的混合液，置于冰上裂解15 min，用細胞刮刮下蛋白，4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，吸取上清至EP管中，-80℃冰箱保存備用。蛋白質含量用BCA蛋白定量的方法進行計算。然后在提取的蛋白質中加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水中煮蛋白質10 min，使其變性，4℃保存備用。配制8%～12%聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳分離(積層膠80 V，分離膠120 V)，350 mA濕轉PVDF膜3 h，TBST配制5%的脫脂牛奶封閉液輕搖封閉2 h，按抗體說明書的比例加入稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次15 min，按說明書稀釋并加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，37℃孵育45 min，然后用TBST洗膜4次，每次10～15 min，用化學發光顯影法進行顯影，以分析軟件AlphaImager 2200分析產物的光密度值(灰度比值=蛋白條帶灰度/內參照蛋白條帶灰度)

2 結果

2.1 姜黃素煙酸酯抑制VSMC增殖并呈現一定的量效、時效關系 與對照組比較，模型組能明顯促進VSMC增殖(P<0.05)；而1、3、10、30、100 μmol·L-1的CurTn則明顯抑制VSMC的增殖(P<0.05)，且抑制作用隨濃度增加而增加(Fig 1)。30 μmol·L-1CurTn處理24、48、72 h后，從Fig 2中可以看出，30 μmol·L-1的CurTn抑制VSMC的增殖(P<0.05)，并具有時效關系。

2.2 煙酸、姜黃素及姜黃素煙酸酯對VSMC增殖的影響 用60 μmol·L-1的煙酸、30 μmol·L-1的姜黃素、30 μmol·L-1的姜黃素煙酸酯處理VSMC 24 h。如Fig 3所示，與對照組比較，體積分數為0.1的FBS明顯刺激VSMC的增殖(P<0.05)，溶媒組與增殖組比較未發生明顯變化；單用煙酸、姜黃素和姜黃素煙酸酯均能抑制VSMC的增殖(P<0.05)，而姜黃素煙酸酯抑制VSMC增殖的作用比單用單體的作用強(P<0.05)。

Fig 1 Does effect of CurTn on the proliferation of ±s，n=3)

VSMC were treated with 10% FBS and stimulated with different concentrations of CurTn for 24 h, and then detected by MTT assay.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsmodel

Fig 2 Time effect of 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC

VSMC treated with 30 μmol·L-1CurTn for 24,48,72 h, and then detected by MTT assay.P<0.05vs24 h or 72 h；#P<0.05vs48 h or 24 h

Fig 3 Effect of 30 μmol·L-1 curcumin, 60 μmol·L-1niacin and 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

2.3 姜黃素煙酸酯對VSMC周期及PCNA蛋白的影響 與對照組比較，模型組和溶媒組細胞G/G1期比例明顯降低，S期比例明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，溶媒組未有明顯的改變；而姜黃素、煙酸、姜黃素煙酸酯能明顯增加G0/G1期比例，降低S期比例(P<0.05)。見Tab 1。

VSMC同步化24 h后，加入藥物處理24 h。與對照組比較，模型組中PCNA蛋白表達明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素、煙酸、姜黃素煙酸酯均能下調PCNA蛋白的表達(P<0.05)；但姜黃素煙酸酯下調PCNA蛋白的表達比單用單體作用明顯(P<0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Influence of CurTn on expression of PCNA in VSMC

VSMC treated with different factors for 24 h,the expression of PCNA was analyzed by Western blot.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

2.4 姜黃素煙酸酯對VSMC增殖中p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達的影響 VSMC同步化24 h后，加入藥物處理24 h。與對照組比較，模型組中p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素、煙酸、姜黃素煙酸酯均能下調p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達(P<0.05)；但姜黃素煙酸酯下調p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達比單用單體作用明顯(P<0.05)。見Fig 5、6。

3 討論

AS是臨床最常見的、由多種因素引起的動脈血管進展性狹窄性疾病，其形成的重要環節為VSMC的異常增殖。現代研究表明，姜黃素能抑制VSMC增殖，發揮抗炎、抗氧化、降血脂等作用，從而延緩AS發生發展。但因體內水溶性差、吸收少及生物利用度低等特點，限制了它在臨床上的應用。煙酸作為一類調脂作用明顯的藥物，發現它發揮抗AS作用可能與其抑制細胞增殖有關。然而，當單用煙酸時存在著促前列腺素合成、易引起皮膚潮紅、瘙癢等副作用。為改善姜黃素的生物利用度，并且保留或提高兩化合物的藥理作用及生物活性，本實驗室將姜黃素和煙酸進行成酯拼合制成姜黃素煙酸酯。實驗室前期研究發現，姜黃素煙酸酯能抑制高脂喂養的ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成，具有抗AS作用，但機制尚未清楚[6]。

GroupControlModelDMSONiacinCurcuminCurTnG0/G1/%62.36±3.72450.21±2.685*51.86±3.993*59.72±2.612#58.16±4.583#60.21±6.250#△S/%27.03±4.05339.36±3.417*38.52±1.623*32.16±1.603#28.18±5.104#29.61±6.726#△G2/M/%10.58±0.42810.44±0.878*9.62±2.4138.10±2.776#13.66±4.030#10.18±0.881#△

VSMC treated with different factors for 24 h , then detected by FCM.P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

Fig 5 Influence of CurTn on expression of CyclinD1 in VSMC

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

Fig 6 Influence of CurTn on expression of p-ERK1/2 in VSMC

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

本實驗以大鼠VSMC為實驗對象，觀察CurTn對體外培養的VSMC增殖的影響。研究發現，CurTn呈劑量和時間依賴性地抑制VSMC的增殖，并且能明顯降低細胞增殖核抗原(PCNA)蛋白的表達。同時結果表明，CurTn比單用煙酸或者單用姜黃素抑制VSMC增殖的作用強。

細胞增殖周期包括DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)以及有絲分裂期(M期)4個階段。G1-S期和G2-M期是細胞生長周期中主要的調控點。CyclinD1是細胞周期重要的調控因子之一，當細胞周期受到外界因素刺激時，CyclinD1與Cdk4形成復合物，誘導細胞增殖。在AS病變反應中，大量的VSMC離開G0/G1期，進入細胞周期,從而進行異常的增殖，促進病變的發生[7]。為探究姜黃素煙酸酯對VSMC周期的影響，我們應用流式細胞術檢測細胞周期，結果證實姜黃素煙酸酯能明顯增加VSMC的G0/G1期的比例，減少G2/S期的比例，使VSMC滯留在G0/G1期，并且CurTn明顯降低CyclinD1蛋白的表達，從而達到抑制細胞增殖的作用。

細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)是介導信號轉導至核內的重要細胞信號分子，其參與從質膜到胞核的信號轉導，是細胞增殖的重要調節因素[8]。有文獻報道[9]，p-ERK1/2抑制劑能降低VSMC CyclinD1蛋白的表達，CyclinD1為p-ERK1/2的下游蛋白。本實驗研究發現，CurTn 也能降低p-ERK1/2蛋白的表達。

綜上所述，本實驗結果表明CurTn能抑制VSMC增殖，并且其比單用煙酸或者單用姜黃素抑制作用更加明顯。其主要機制可能是通過下調p-ERK1/2蛋白表達，使CyclinD1蛋白的表達減少，從而減慢細胞周期G1/S期轉換，細胞滯留在G0/G1期，抑制VSMC增殖。這為其作為AS疾病的防治藥物提供了新的理論和實驗依據。

(致謝：本實驗主要在湖南中醫藥大學干細胞調控與應用實驗室及南華大學藥物藥理研究所完成，在此對實驗室各位老師及同學的幫助表示衷心的感謝！)

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Effects of CurTn on proliferation of VSMC

YANG Dong-mei1, YANG Wei2, QIU Fei1, SUN Si-yu1, CHEN Jian-xiong3,ZHANG Cai-ping2, XIONG Guo-zuo2, TUO Qin-hui2,4, LIAO Duan-fang1,2

(1.SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.IntegrativeHeartandBrainDiseasePreventionandControlLaboratory,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;4.SchoolofMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Aim To explore the anti-proliferation effects of curcumin trinicotinate (CurTn) on vascular smooth muscle cell (VSMC) and its mechanism. Methods The cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. MTT assay was used to examine cell proliferation. FCM was used to observe cell cycle. The expressions of PCNA, CyclinD1 and p-ERK1/2 were analyzed using Western blot. Results CurTn could inhibit the proliferation of VSMC and showed a certain amount-time relationship. What’s more， CurTn could increase the G1phase proportion of cell, decrease the S phase proportion and the expression level of PCNA protein. It was also found that CurTn significantly inhibit the protein expression of p-ERK1/2 and Cyclin D1. Conclusion CurTn may inhibit the proliferation of VSMC via downregulating the expression of CyclinD1 and p-ERK1/2 .

curcumin trinicotinate; niacin; curcumin; VSMC; proliferation; ERK; mechanism

2016-07-12，

2016-08-20

國家自然科學基金資助項目(No 81673722，816700291，81670268)；湖南省自然科學基金資助項目(No 14JJ1024，2015JJ2117)；湖南省教育廳重點項目(No 16A156)

楊冬梅(1991-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail:15273124659@163.com；

陽 巍(1987-)，男，碩士，研究方向：心血管藥理學，共同第一作者，E-mail:36828972@qq.com；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.010

A

1001-1978(2016)11-1526-05

R284.1；R322.74；R329.24；R543.5；R977.6

庹勤慧 (1974-)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail: qhtuo@aliyun.com；

廖端芳(1959-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail:dfliao66@aliyun.com