無創性延遲肢體缺血預適應對心臟性猝死的預防作用研究

李 燕，陳文華,2，孫 凱，張 穎，安夢瑤，潘瑩瑩，吳艷娜，康 毅，高衛真，婁建石

(1.天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070；2.寧夏醫科大學總醫院，寧夏 銀川 750004)

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無創性延遲肢體缺血預適應對心臟性猝死的預防作用研究

李 燕1，陳文華1,2，孫 凱1，張 穎1，安夢瑤1，潘瑩瑩1，吳艷娜1，康 毅1，高衛真1，婁建石1

(1.天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070；2.寧夏醫科大學總醫院，寧夏 銀川 750004)

目的 研究無創性延遲肢體缺血預適應(NDLIP)對心臟猝死的預防作用。方法 取健康，體質量(250±10) g的SD ♂大鼠30只，隨機分為3組，① 心肌梗死(MI)組：手術結扎動物冠狀動脈左前降支(left anterior descending artery，LAD)，2周后成模；② MI+NDLIP組：動物心肌梗死模型成功后，每隔1 d進行1次遠端肢體缺血預適應，直至第4周；③ 假手術(Sham)組：作為陰性對照組，心臟LAD只穿線不結扎，不實施NDLIP。各組動物常規飼養，于4周末靜脈輸注間羥胺(0.2 mg·min-1)進行猝死，記錄致猝死過程中的ECG、猝死藥物累積量、猝死時間，于猝死末期腹主動脈取血，ELISA法測定血清caspase-3、HSP70、SOD含量。結果 間羥胺致動物心臟猝死時，隨著給藥量的增加，動物的心率呈下降趨勢，記錄給藥0、5、10、30、50、70、90 min時動物的心率。與MI組相比， MI+NDLIP組給藥0、5、10、30、50 min時動物心率[(479±8)vs(416±19) beat·min-1，(446±32)vs(370±20) beat·min-1，(376±53)vs(305±29) beat·min-1，(307±63)vs(244±33) beat·min-1，(283±45)vs(121±35) beat·min-1，P<0.01]明顯較高。與MI組相比，MI+NDLIP組動物的致猝死藥物累積量、猝死時間[(14.58±3.03)vs(10.76±2.73) mg，(72.9±15.2)vs(53.8±13.6) min，P<0.01]都明顯增加。與MI組相比，MI+NDLIP組血清caspase-3[(2.01±0.52)vs(2.34±0.38) μg·L-1，P<0.01]表達量明顯降低；HSP70[(3.01±0.58)vs(2.70±0.43) μg·L-1，P<0.05]水平明顯升高；SOD [(1.99±0.65)vs(1.70±0.58) mg·L-1，P<0.01]水平明顯升高。結論 無創性延遲肢體缺血預適應能有效預防大鼠心梗后心臟性猝死，其機制可能與降低心肌細胞凋亡、增加保護性蛋白的表達以及增強心肌抗氧化能力有關。

心臟猝死；心肌梗死；無創性延遲肢體缺血預適應；caspase-3； HSP70；SOD

心臟性猝死(sudden cardiac death，SCD)是指因心臟原因導致的突然死亡。SCD最常見的病因是冠心病，尤其是患有急性心肌梗死的患者。心肌梗死造成的局部心肌缺血誘導折返性心律失常形成，進一步加重病變組織與正常組織的復極離散性，最終導致惡性心律失常而誘發猝死[1-3]。同時，機體內環境失調，如交感神經過度興奮、迷走神經功能低下等可增加心肌梗死患者心肌電不穩定性，更易誘發嚴重室顫而致死。

目前在預防SCD方面，高危人群通常采用埋藏式心臟復律除顫器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)，但由于費用昂貴，在我國的應用并不廣泛；中國的自動體外除顫器(automatic external defibrillator，AED)使用率低；抗心律失常藥物胺碘酮、β受體阻滯劑，以及血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)、血管緊張素受體阻斷劑(angiotensin receptor blockers，ARBs)與他汀類藥物等仍是預防SCD的主要手段，但是單獨作為SCD的預防性措施卻遠遠不夠[4-9]。因此，探索更加有效的預防SCD的方法仍是今后研究的難點和熱點。

遠端缺血預適應是一種安全無創、成本低的技術。不少研究證實無創性延遲肢體缺血預適應(noninvasive delayed limb ischemic preconditioning，NDLIP)可減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，對心肌具有保護作用[10-13]。本室前期實驗研究證實NDLIP可減輕心肌梗死后心肌損傷，降低心肌過氧化損傷，減少心律失常[14-16]，對心肌梗死預后有積極作用。因此，我們設想NDLIP是否能對心肌梗死后的心臟性猝死起到一定的預防作用。本實驗將探索其對大鼠心肌梗死后SCD的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 鼠齡相同、體質量(250±10) g的SD ♂大鼠30只[SPF級，實驗動物質量合格許可證號：SCXK-(軍)2012-0004]，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 0.9% 氯化鈉注射液(sodium chloride injection；生理鹽水，normal saline，NS)，天津大冢制藥有限公司，中國；肝素鈉注射液，天津生物化學制藥有限公司，中國；氨基甲酸乙酯(烏拉坦，urethane)，上海展云化工有限公司，中國；戊巴比妥鈉，Sigma，美國；重酒石酸間羥胺注射液，天津金耀藥業有限公司，中國；二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司，中國；胱天蛋白酶3(caspase-3)試劑盒、熱休克蛋白70(HSP70)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均為加拿大Hermes Criterion Biotechonlogy產品。

1.1.3 儀器 BL-420S生物機能實驗系統、HX-100E小動物呼吸機，成都泰盟科技有限公司；外科手術器械，張家港市雙鹿醫療器械有限公司；L420臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HZS-H水浴震蕩器，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；WZ-50C6型微量注射泵，上海軟隆科技發展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 ① 心肌梗死組(MI group，n=10)；②心梗+無創性肢體缺血預適應組(MI+NDLIP group，n=10)；③假手術組(Sham group，n=10)。各組動物第4周時進行心臟猝死實驗。

1.2.2 模型建立 心肌梗死模型：大鼠用3%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。暴露心臟后，迅速在左心耳與肺動脈圓錐交界處平左心耳下緣2 mm進針，以7-0手術縫合線結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending artery，LAD)。結扎完成后，立即將心臟放回胸腔，置入塑料軟管并與注射器連接，迅速對合、捏緊皮膚，抽出胸腔內氣體，立即拔管并進行胸外按壓。觀察心電圖，心搏正常且動物呼吸平穩后，進行縫合。傷口消毒，保持體溫在36.5～38℃。肌肉注射20萬U青霉素鈉預防感染。

無創性肢體缺血預適應模型：大鼠用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，以改良的動物無創血壓測試儀自制套管套住大鼠左后肢根部，脈搏傳感器緊貼在足背動脈上，加壓使脈搏消失、肢體遠端體溫下降、皮膚發紺，即為阻斷股動脈標志，持續5 min；減壓，脈搏出現、體溫回升、皮膚潮紅，為再灌標志，持續5 min，共3個循環。心肌梗死模型成功后，每隔1 d進行1次遠端肢體缺血預適應，直至4周。

心臟猝死模型：各組動物在第4周時進行猝死實驗。動物用25%烏拉坦麻醉。分離大鼠左側頸總動脈，行心室插管，監測大鼠血流動力學參數。分離右側頸總靜脈，做靜脈插管，連接恒速輸液裝置。檢查好后打開恒速輸液泵，開始給予重酒石酸間羥胺進行猝死，給藥速率0.2 mg·min-1，同時開始記錄電生理參數。

1.2.3 觀測指標及方法

1.2.3.1 NDLIP對動物猝死實驗時電生理學的影響 檢測并記錄動物在進行心臟猝死實驗時的血流動力學指標。

1.2.3.2 NDLIP對動物猝死時間的影響

1.2.3.3 NDLIP對動物猝死時藥物累積量的影響

1.2.3.4 血清caspase-3、HSP70、SOD的含量測定 各組動物于猝死末期腹主動脈取血約5 mL，室溫(25℃)放置1 h，離心取血清(3 000 r·min-1，15 min)，置于-80℃保存作為樣品。采用ELISA法測定標本中caspase-3、HSP70、SOD水平。

2 結果

2.1 模型的建立 LAD結扎前心電圖正常，結扎后出現R波峰減低，然后出現ST段抬高和ST-T融合，出現明顯的病理性Q波。2周后，心電圖近乎正常，T波低平；開胸后，可見明顯的心肌梗死區，其顏色發白，與周圍心肌形成明顯的分界，且梗死局部室壁運動減低或消失。表明大鼠心肌梗死模型建立成功。心肌梗死模型建立成功后，我們使用間羥胺致心梗大鼠猝死，大鼠心率逐漸減慢，心臟收縮力減弱，1 h內發生猝死。

2.2 NDLIP對動物猝死實驗過程中心臟電生理學的影響 采用間羥胺致動物心臟猝死時，隨著給藥量的增加，動物心率呈下降趨勢。Sham組動物心率下降緩慢，直至90 min時動物仍有心率。MI組動物心率下降最為迅速，分別比Sham組心率低8%、10%、22%、29%、58%，且動物均在60 min內猝死；MI+NDLIP組動物心率下降較MI組緩慢，在每個監測時段的心率都比MI組高(Fig 1)，分別比MI組高15%、20%、23%、26%、133%(P<0.01)。

Fig 1 Changes of heart rate in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△P<0.05，△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group. MI: myocardial infarction；NDLIP: noninvasive delayed limb ischemic preconditioning

2.3 NDLIP對動物猝死實驗過程中致猝死藥物累積量以及猝死時間的影響 如Fig 2 和Fig 3顯示，MI組動物所用致猝死藥物量以及猝死時間明顯少于Sham組，分別減少了49%(P<0.01)。MI+NDLIP組所用致猝死藥物的累積量和猝死時間分別比MI組增加36%和35%(P<0.01)，表明NDLIP干預后，情況明顯改善。

2.4 NDLIP對caspase-3、HSP70以及SOD表達的影響 動物血清caspase-3表達量(Fig 4)：Sham組最低，MI組比Sham組高56%(P<0.01)，MI+NDLIP組比MI組減少了14%(P<0.01)。動物血清HSP70表達量(Fig 5)：Sham組最低，MI組比Sham組高，但差異無顯著性，MI+NDLIP組比MI組增加了11%(P<0.05)。動物血清SOD表達量(Fig 6)： Sham組最高，MI組比Sham組低33%(P<0.01)，MI+NDLIP組比MI組增加了17%(P<0.01)。

Fig 2 Drug cumulant amount in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 3 Sudden death onset time in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 4 Level of serum caspase-3 concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1)

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 5 Level of serum HSP70 concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1)

*P<0.05vsMI group

Fig 6 Level of serum SOD concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

3 討論

本實驗首先建立大鼠心肌梗死模型，隨后用藥物制備大鼠心肌梗死后心臟猝死模型。心臟猝死的誘因有多種，其中交感神經過度興奮為常見原因。在模擬臨床病人心梗后交感神經過度興奮所致猝死的基礎上，本實驗首次探索并建立以擬腎上腺素藥誘發心肌梗死大鼠發生猝死模型。

首先，我們需要選擇合適的工具藥，對工具藥我們有以下要求：① 藥物的作用靶點主要在心血管系統；② 藥物致猝死的時間要合適，根據心臟猝死的定義，我們需要的理想猝死時間是1 h左右；③ 藥物易得，且毒性小。基于以上要求，我們選擇了以下藥物：腎上腺素、異丙腎上腺素、去氧腎上腺素、麻黃堿、間羥胺。我們發現，上述除間羥胺外的藥物誘發猝死率低，且誘發猝死所需用藥量大。而間羥胺所致心肌梗死大鼠心臟猝死的藥物累積劑量為10.0 mg,且在1 h內猝死，所以我們使用間羥胺制備心臟猝死模型。

在猝死實驗中，我們使用NDLIP進行干預后，發現需要使用更多的間羥胺才能使心梗大鼠發生猝死，且猝死時間延長，分析其原因：一方面，可能通過抑制凋亡蛋白表達量、增加保護性蛋白表達量、增強心肌抗氧化能力來保護心肌細胞；另一方面，我們推測可能與降低交感神經興奮度有關。

心肌梗死過程中，大量心肌細胞凋亡。研究證實，心肌細胞的凋亡是由一系列caspase級聯反應引起的，尤其是caspase-3。caspase-3造成細胞凋亡的機制是激活核酸內切酶，造成DNA裂解，破壞細胞內的鈣泵功能，導致細胞內鈣超載等[17-19]。在有害應激狀態下，HSP70表達量增加。許多動物學實驗表明HSP70對心肌有保護作用，可通過抗氧化作用、抗細胞凋亡作用、抗自由基等作用保護心肌細胞，并通過抑制NADPH氧化酶減少氧自由基的產生。HSP70表達增加可抑制caspase依賴性的心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積，明顯改善心功能[20-22]，同時，增加SOD，加快清除自由基。機體病理狀態下會產生大量的自由基，大量的氧自由基又可轉變為活性更強的羥自由基，使細胞膜脂質過氧化，引起膜結構和膜功能的損害。體內SOD的水平變化可反映機體的抗氧化功能[23-25]。SOD的水平越高，表明體內的抗氧化酶的水平越高，心肌損傷較輕。我們使用NDLIP進行干預后，MI大鼠的caspase-3表達量明顯降低，HSP70表達量明顯增加，SOD表達量明顯增加。這表明NDLIP發揮預防猝死的作用可能與降低心肌細胞凋亡程度，增加保護性蛋白的表達量，增強心肌抗氧化能力相關。

心臟同時受到交感神經和副交感神經的雙重支配，這兩者之間的平衡對于維持正常的心功能至關重要。有研究表明，遠端缺血預適應可刺激心肌神經平衡再生[26]。因此，我們推測NDLIP發揮預防猝死的作用可能也與抑制交感神經過度興奮，維持心臟自主神經功能平衡有關。

總之，我們通過探索和實驗最終提出用間羥胺來制備大鼠心肌梗死后猝死模型，這為心臟猝死的研究提供了新的途徑。同時，在此基礎上，我們證實NDLIP對心肌梗死后的心臟猝死具有一定的預防作用，其作用機制可能與降低心肌細胞凋亡、增加保護性蛋白表達量以及增強心臟抗氧化能力等相關。今后，通過對NDLIP對心肌損傷保護作用的機制以及對心臟自主神經的影響進行更為深入的探究，將能為臨床預防心肌梗死患者發生心源性猝死提供新的思路。

(致謝：本文實驗是在天津醫科大學基礎醫學院藥理學系藥理學實驗室完成，感謝實驗室成員的參與和幫助！)

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Preventative effects of noninvasive delayed limb ischemic preconditioning on sudden cardiac death in rats after myocardial infarction

LI Yan1, CHEN Wen-hua1,2, SUN Kai1, ZHANG Ying1, AN Meng-yao1,PAN Ying-ying1, WU Yan-na1, KANG Yi1, GAO Wei-zhen1, LOU Jian-shi1

(1.DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China；2.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To study the preventative effects of noninvasive delayed limb ischemic preconditioning (NDLIP) on sudden cardiac death in rats with myocardial infarction. Methods Thirty healthy SD male rats weighting (250±10) g were randomly divided into 3 groups: ① myocardial infarction (MI) group: animal model of MI was established by making surgical ligation of animal LAD. ② MI plus NDLIP group: after the success of the animal model of MI, NDLIP was carried out every other day until 4th week. ③ Sham group: as the negative control group, animals were taken heart LAD threading but no ligation. All rats were fed conventionally. At the end of 4 weeks, three groups of rats were administered with metaraminol(0.2 mg·min-1). ECG, drug cumulant of sudden death and death onset time were recorded. After sudden death, blood samples were withdrawn from abdominal aorta and serum was separated via centrifugation. ELISA method was used to measure serum caspase-3, HSP70 and SOD concentration. Results While metaraminol led animal cardiac sudden death, the rats heart rate (HR) kept declining with the increase of dosage of metaraminol during the administration period. Rat HR of MI+NDLIP group [(479±8)vs(416±19) beat·min-1, (446±32)vs(370±20) beat·min-1, (376±53)vs(305±29) beat·min-1, (307±63)vs(244±33) beat·min-1, (283±45)vs(121±35) beat·min-1,P<0.01] was markedly higher than that of MI group at 0, 5, 10, 30, 50 min before death. Compared with MI group, drugs cumulant to sudden death and death onset time of MI+NDLIP group [(14.58±3.03)vs(10.76±2.73) mg, (72.9±15.2)vs(53.8±13.6) min,P<0.01] were significantly increased. Compared with MI group, serum caspase-3 content of MI+NDLIP group was significantly reduced [(2.01±0.52)vs(2.34±0.38) μg·L-1,P<0.01]; HSP70 levels were remarkably increased [(3.01±0.58)vs(2.70±0.43) μg·L-1,P<0.05]; SOD levels were significantly improved [(1.99±0.65)vs(1.70±0.58) mg·L-1,P<0.01]. Conclusion NDLIP can prevent sudden cardiac death after myocardial infarction in rats, which may be mediated by reducing the myocardial cell apoptosis, increasing protective protein expression and enhancing antioxidant capacity.

sudden cardiac death; myocardial infarction; noninvasive delayed limb ischemic preconditioning; caspase-3; HSP70; SOD

2016-06-20，

2016-07-18

國家自然科學基金資助項目(No 81072631)；天津自然科學基金資助項目(No 09JCZDJC21100)

李 燕(1992-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學， E-mail：m_159221f@163.com；

陳文華(1991-)，女，碩士，初級藥師，并列第一作者，E-mail：feixue120003@163.com；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.034.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.017

A

1001-1978(2016)11-1565-06

R-332；R323.7；R364.12；R541.022；R542.22

婁建石(1954-)，男，碩士，教授，博士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，Tel：022-83336860，E-mail：jianshilou@126.com