低氧與常氧狀態下羅紅霉素在大鼠體內的藥代動力學比較

邵 濤，秦 一，徐平湘,3，徐唯哲，趙 亮，馬 毅， 郝維佳，薛 明,3

(1. 首都醫科大學基礎醫學院藥理學系，北京 100069；2.中國航天科工集團七三一醫院藥劑科，北京 100074；3.生物醫學檢測技術與儀器北京實驗室，北京 100069)

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低氧與常氧狀態下羅紅霉素在大鼠體內的藥代動力學比較

邵 濤1,2，秦 一1，徐平湘1,3，徐唯哲1，趙 亮1，馬 毅1， 郝維佳1，薛 明1,3

(1. 首都醫科大學基礎醫學院藥理學系，北京 100069；2.中國航天科工集團七三一醫院藥劑科，北京 100074；3.生物醫學檢測技術與儀器北京實驗室，北京 100069)

目的 研究比較在低氧和常氧條件下，常用抗生素羅紅霉素在大鼠體內的藥代動力學特征。方法 建立快速高效的超高效液相質譜聯用法，測定大鼠血漿中羅紅霉素的濃度。SD大鼠灌胃給予羅紅霉素(10 mg·kg-1)，測定不同時間點的大鼠血漿藥物濃度，分別計算低氧與常氧大鼠的主要藥代動力學參數，并進行統計分析。結果 在1～1 000 μg·L-1濃度間，羅紅霉素在血漿中有良好的線性關系，定量下限為1 μg·L-1。羅紅霉素在常氧和低氧大鼠體內主要藥動學參數分別為：AUC(0-t)7 576 μg·h· L-1和 3 761 μg· h·L-1；MRT(0-t)5.6 h和7.7 h；T1/23.4 h和3.9 h；tmax3.1 h和 3.4 h；Cmax1 116 μg·L-1和372 μg·L-1；CL 1.5 和3.0 L·h-1·kg-2。與常氧大鼠藥動學參數比較，低氧狀態下羅紅霉素在大鼠體內的藥動學參數Cmax和AUC均有明顯降低。 結論 低氧條件下，羅紅霉素在大鼠體內的體內暴露量明顯降低，結果為羅紅霉素在低氧狀態下的給藥方案優化和調整提供了重要的實驗依據。

羅紅霉素；超高效液相色譜-質譜聯用法；低氧；常氧；藥代動力學；大鼠血漿

低氧(hypoxia)是影響生命活動和疾病發展的重要因素之一，在低氧環境下，機體組織器官的代謝功能會發生異常變化[1-2]，結果會影響藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄等藥代動力學過程，進而影響藥物的療效和毒性[3-4]。因此，隨著藥代動力學研究的深入和臨床個體化給藥的需求，尤其是高原低氧環境影響和急進高原人群的增加，人們越來越關注低氧對藥物藥代動力學的影響及其后果[5]。在高原低氧條件容易引起呼吸系統感染，而羅紅霉素(roxithromycin)是臨床治療肺部感染的常用抗生素之一, 羅紅霉素配合頭孢類等抗生素廣泛用于高原呼吸系統的感染治療[6-9]。同時，羅紅霉素對支原體肺炎和解脲脲原體引起的泌尿系統感染等也有良好療效[10]。在藥代動力學方面，羅紅霉素耐酸而不易被胃酸破壞，在胃腸道吸收好，維持血藥濃度較高水平，其峰值為所有大環內酯類最高，組織分布廣泛[11-12]。基于羅紅霉素的抗感染療效與其體內血藥濃度水平和藥代動力學特征密切相關，因此，本文應用我們建立的UPLC-MS/MS方法研究比較了低氧和常氧狀態下大鼠體內藥代動力學特征，結果為臨床合理用藥提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 羅紅霉素(批號：130557-201103)和克拉霉素(批號： 130558-201303)標準品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥99%，結構見Fig 1。乙腈、甲醇購自Thermo Fisher 公司 (Waltham, Australia)。實驗所用水為雙蒸水，甲酸購自Dikma Reagent 公司 (Beijing, China)。實驗所用其他試劑純度均為色譜級別。

1.2 實驗動物 Sprague-Dawley (SD) 大鼠，體質量220 g～260 g，♂，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號：SCXK (京) 2012-0001。頸靜脈插管大鼠，體質量為220 g～260 g，♂，購自思科諾思生物科技有限公司，實驗動物合格證號：SCXK (京) 2016-0001。動物實驗部分經過首都醫科大學動物倫理委員會批準，動物倫理編號AEEI-2016-016。1.3 儀器 Agilent 1290超高效液相色譜儀聯用Agilent 6490三重四級桿質譜；2D5-2A型低速離心機(北京醫用離心機廠產品)；高速離心機(美國Sigma公司)；萬分之一電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；Vortex-Genie 2旋渦混合器(美國SI公司)；ZORBAX Eclipse Plus-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d，3.5 μm，美國Agilent公司)；pH測試計(德國賽多利斯公司)；一次性針頭式尼龍濾膜(0.22 μm，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；1～10 μL，1～200 μL及1～1 000 μL移液器(德國Brand公司)。

Fig 1 Chemical structures of roxithromycin (A) and clarithromycin (B)

1.4 色譜與質譜條件 液相色譜 (liquid chromatography，LC)：流動相為乙腈 ∶水(35 ∶65，V/V)(水相中加入15 mmol·L-1乙酸)，流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。質譜部分：電噴霧離子化離子源(electro spray ionization，ESI)，正離子檢測模式；干燥氣溫度為200 ℃；干燥氣體流速為16 L·min-1；噴霧器壓力為35 Psi；鞘氣溫度為250 ℃；鞘氣 (N2)流速為12 L·min-1；毛細管電壓為3 500 V；噴嘴電壓為1 500 V。質譜掃描方式為多重反應監測模式(multiple reaction monitoring, MRM)，定量分析的離子(m/z) 分別為837.5→679.5(羅紅霉素，20 ev)和748.5.→158.1(內標為克拉霉素，30 ev)。1.5 血漿樣品處理 取1.5 mL離心管，加入大鼠血漿樣品100 μL，加入濃度為200 μg·L-1的內標克拉霉素溶液10 μL，渦旋混勻。之后加入300 μL甲醇進行蛋白沉淀，每個樣品均渦旋2 min,使其充分混勻，于13 000 r·min-1高速離心10 min。用一次性針頭吸取上清液，過0.22 μm的有機膜，轉移到樣品瓶內插管中。進樣體積均為5 μL。1.6 標準溶液配置 分別精密稱取羅紅霉素和克拉霉素5 mg，溶解于5 mL容量瓶中，以色譜級甲醇定容，分別配制成1 g·L-1的克拉霉素和羅紅霉素標準儲備液。再用流動相將羅紅霉素儲備液稀釋成梯度工作液：10 000、5 000、1 000、500、100、50、10 μg·L-1，同時將內標克拉霉素儲備液稀釋成200 μg·L-1的工作液。將儲備液和工作液均保存在4 ℃冰箱中備用。1.7 羅紅霉素在大鼠體內的藥代動力學比較

1.7.1 常氧狀態下的藥代動力學 將6只♂ SD插管大鼠分別編號并稱重，按照10 mg·kg-1的給藥劑量，灌胃給藥。給藥前禁食12 h，自由飲水。分別于給藥前和給藥后5、10、20、30 min及1、2、4、6、8、16、24、36 h經頸靜脈取血約0.4 mL，置于含肝素的EP管中，13 000 r·min-1離心10 min，分離得到上層血漿。之后按“1.5”項下操作處理。

2 結果

2.1 方法學考察與驗證

2.1.1 方法的專屬性 按照“1.4”的質譜條件，分別對羅紅霉素和內標克拉霉素進行質譜全掃，測得羅紅霉素的核質比為：m/z 837.5→679.5(Fig 2)、克拉霉素為：m/z 748.5→158.1(Fig 2)。大鼠空白血漿、空白血漿外加藥物、大鼠給藥后血漿樣品經處理后的MRM模式色譜圖見Fig 3，由圖可見，羅紅霉素與內標克拉霉素在血漿中無內源性干擾。羅紅霉素的出峰時間為1.8 min，內標的出峰時間為1.6 min。2.1.2 標準曲線及定量下限 取1.5 mL離心管數支，分別加入梯度濃度的羅紅霉素溶液10 μL和內標溶液 (200 μg·L-1) 10 μL，再分別加入大鼠空白血漿100 μL，渦旋混勻，配制成羅紅霉素濃度分別為1、5、10、50、100、500、1 000 μg·L-1的含藥血漿。按“1.5”項下操作，進行LC-MS/MS分析。以羅紅霉素質量濃度X(μg·L-1)為橫坐標，羅紅霉素與內標峰面積之比Y為縱坐標，采用加權 (1/X2) 最小二乘法進行線性回歸，制作標準曲線，得到回歸方程為Y=0.028+0.016X，r2=0.991。多次測量最低定量下限(S/N>10)，其值為1 μg·L-1。

2.1.3 準確度與精密度測定 配制羅紅霉素濃度分別為1、2、200、800 μg·L-1的含藥血漿作為質控樣品，在1 d內每個濃度各配制5份樣品，計算樣品和內標峰面積的比值，代入隨行的標準曲線，得出樣品的濃度，計算日內準確度與精密度。連續測定3 d共3批樣品，計算日間準確度與精密度，結果見Tab 1。從表中看出，大鼠血漿質控樣品的日內、日間精密度均小于9%，準確度均在±11.2%以內，符合生物樣品分析要求。

Fig 2 Product ions of roxithromycin and clarithromycin (IS)

2.1.4 提取回收率與基質效應 配制羅紅霉素濃度分別為1、2、200、800 μg·L-1的含藥血漿，每個濃度平行5份，測定所得羅紅霉素的峰面積與空白血漿經樣品處理后加入對應濃度的標準溶液的峰面積之比，計算提取回收率；空白血漿經過樣品處理后加入最低定量下限、低、中、高4個濃度的標準溶液得到的峰面積與對應濃度的標準溶液的峰面積之比，計算基質效應，結果見Tab 2。結果表明，羅紅霉素在該方法下回收率在76.8%以上，基質效應控制在±15.3%之內。

Tab 1 Intra-and inter-day of precision and accuracy of roxithromycin ±s, n=5)

Tab 2 Recovery and matrix effect of roxithromycin in rat plasma ±s, n=5)

2.1.5 穩定性 配制羅紅霉素濃度分別為1、2、200、800 μg·L-1的含藥血漿，每個濃度平行5份，分別考察其室溫放置4 h、3次凍融循環和-80℃凍存30 d穩定性。結果表明，與0時刻含藥血漿相比較，變異均在1%范圍內(Tab 3)。表明含藥血漿在上述條件下穩定。

Tab 3 Stability of roxithromycin in rat plasma ±s, n=5)

2.2 羅紅霉素在常氧和低氧大鼠體內的藥代動力學比較 對常氧狀態和低氧狀態下的大鼠，分別給藥后測定其對應時間點的血漿中羅紅霉素的峰面積，并根據回歸方程計算血藥濃度。常氧與低氧狀態下，相同劑量組的羅紅霉素在大鼠體內對應的藥物濃度-時間曲線見Fig 4。

將得到的羅紅霉素血藥濃度數據用藥動學處理軟件(DAS)處理后，得到常氧與低氧狀態下大鼠的體內藥物代謝動力學參數，見Tab 4。

3 討論

我們用特制的低氧操作裝置維持環境9%的氧分壓，將大鼠置于9%的氧氣環境中72 h，建立了常壓大鼠急性低氧模型[13-14]。該低氧裝置的優點在于可設定不同程度的低氧環境，并且能保持氧濃度的恒定，在氣體環境條件改變后可以迅速恢復，模擬低氧環境的重現性高。

Fig 3 Chromatograms of rat plasma with roxithromycin and internal standard

A:Blank rat plasma; B: Blank rat plasma spiked with roxithromycin (200 μg·L-1) and internal standard (200 μg·L-1); C: Rat plasma sample obtained 8 h after p.o. administration with a dose of 10 mg·kg-1of roxithromycin.

Fig 4 Mean plasma concentration-time curves of roxithromycin in normoxic and hypoxic rats following intragastric administration to rats (n=6)

ParametersNormoxicgroupHypoxicgroupAUC(0-t)/μg·h·L-17576±17653761±1202**AUC(0-∞)/μg·h·L-17586±17693777±1219**MRT(0-t)/h5.6±0.77.7±0.9*MRT(0-∞)/h5.6±0.87.9±0.9*T1/2/h3.4±0.83.9±0.9tmax/h3.1±1.53.4±2.3V/L·kg-16.5±0.916.5±4.7**CL/L·h-1·kg-21.5±0.53.0±0.8*Cmax/μg·L-11116±293372±102**

*P<0.05,**P<0.01vsnormoxic group

超高效液相質譜聯用的采用，提高了液相的分離測定效率[15-17]。經測定，常氧條件下羅紅霉素在大鼠體內的主要藥動學參數為：AUC(0-t)7 576 μg·h·L-1，MRT(0-t)5.6 h，T1/23.4 h，CL 1.5 L·h-1·kg-2，tmax3.1 h，Cmax1 116.2 μg·L-1。羅紅霉素在低氧條件下的主要藥動學參數為：AUC(0-t)3 761 μg· h·L-1，MRT(0-t)7.7h，T1/23.9 h，CL 3.0 L·h-1·kg-2，tmax3.4 h，Cmax372.1 μg·L-1。比較低氧與常氧狀態下，羅紅霉素在大鼠體內的藥代動力學參數可見，低氧狀態下，Cmax與AUC的值明顯降低，提示羅紅霉素在低氧狀態大鼠體內的吸收降低，體內暴露量明顯減低。低氧狀態下，羅紅霉素的清除率CL明顯增加，提示單位時間內每毫升血漿中羅紅霉素被機體清除的量增大，這也可能是低氧狀態AUC與體存量降低的原因。低氧狀態下的T1/2和tmax與常氧的參數差異沒有統計學意義，提示羅紅霉素在低氧大鼠體內的消除半衰期和體內平均貯留時間沒有明顯變化。

羅紅霉素脂溶性很強，容易透過生物膜，一般通過一級動力學被動擴散方式進行體內轉運。而低氧狀態下，藥物的吸收和體存量減少，可能一方面源于外排蛋白，另一方面也可能是缺氧造成腸胃排空變慢，pH變化影響藥物電離性，或者造成胃腸局部微環境改變，進而影響藥物吸收[3, 4, 18]。低氧影響羅紅霉素在動物體內代謝轉運和藥代動力學過程的分子機制尚待進一步研究。我們的研究結果表明，低氧可以明顯降低羅紅霉素在大鼠體內的達峰濃度和體存量，降低血漿藥物濃度水平，進而影響藥物治療，結果為羅紅霉素在低氧狀態下的給藥方案優化和調整提供了重要的實驗依據。與常氧狀態相比，缺氧狀態下，羅紅霉素的體內消除半衰期沒有發生明顯變化，但體內吸收和暴露量明顯降低。因此，在缺氧狀態下臨床使用羅紅霉素時，給藥次數和時間間隔不變，但給藥劑量至少需要增大1倍。

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Pharmacokinetic comparison of roxithromycin under normoxic and hypoxic conditions in rats by UPLC/MS/MS

SHAO Tao1,2，QIN Yi1，XU Ping-xiang1,3，XU Wei-zhe1，ZHAO Liang1，MA Yi1, HAO Wei-jia1，XUE Ming1,3

(1.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2.DeptofPharmacy,Aerospace731Hospital,Beijing100074,China; 3.BeijingLaboratoryforBiomedicalDetectionTechnologyandInstrument,Beijing100069,China)

Aim To study and compare the pharmacokinetic parameters of roxithromycin under normoxic and hypoxic rats. Methods A highly effective and rapid ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method with positive electrospray ionization source was successfully developed and validated for quantification of roxithromycin in rat plasma. Sprague-Dawley rats were randomly divided into the hypoxia and normoxic groups. Each rat obtained a single dose of roxithromycin with 10 mg·kg-1via intragastric administration. The pharmacokinetic parameter comparison between normoxic and hypoxic groups was calculated by SPSS software using independent samplettest method. Results The main pharmacokinetic parameters of roxithromycin between the normoxic and hypoxic rats were: the AUC(0-t)7 576 and 3 761 μg·h·L-1, MRT(0-t)5.6 and 7.7 h,T1/23.4 h and 3.9 h, CL 1.5 and 3.0 L·h-1·kg-2,tmax3.1 and 3.4 h,Cmax1 116 and 372 μg·L-1, respectively. The levels ofCmaxand AUC of roxithromycin in hypoxic rats were statistically lower than those in normoxic rats. Conclusion The exposure level of roxithromycin in hypoxic rats markedly decreased. Our results may provide an important experimental basis to adjust the dosage for roxithromycin in hypoxic clinical practice.

roxithromycin; UPLC-MS/MS; hypoxia; normoxia; pharmacokinetics; rat plasma

2016-07-18，

2016-08-20

國家自然科學基金面上項目 (No 81173121，81573683)

邵 濤(1985-)，男，碩士生，研究方向：藥代動力學，Tel：010-88538347；E-mail：soar_airy@163.com；

薛 明(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：藥物代謝和系統生物組學，通訊作者，Tel：010-83911520， E-mail: xuem@ccmu.edu.cn

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.044.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.022

A

1001-1978(2016)11-1596-06

R-332；R845.22；R969.1；R978.15