小鼠異種皮膚移植模型的建立及對免疫抑制藥物的藥效評價

蔡春曉，馬春梅，孟立正，田華潔，黃曉星，劉 莉，梅其炳

(1.中國醫藥工業研究總院藥理評價研究中心，上海 200040；2. 上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺，上海 200437；3. 上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437)

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◇實驗方法學◇

小鼠異種皮膚移植模型的建立及對免疫抑制藥物的藥效評價

蔡春曉1，2，3，馬春梅1，2，3，孟立正1，2，3，田華潔1，2，3，黃曉星1，2，3，劉 莉1，2，3，梅其炳1，2，3

(1.中國醫藥工業研究總院藥理評價研究中心，上海 200040；2. 上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺，上海 200437；3. 上海醫藥工業研究院創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437)

目的 建立小鼠異種皮膚移植模型，以期為免疫抑制藥物提供研究模型。方法 將C57BL/6小鼠耳部皮膚移植到BALB/c小鼠背部，同時設立同種移植對照(BALB/c小鼠耳部皮膚移植到BALB/c小鼠背部)。選用環孢素A作為抑制異種移植引起的免疫排斥反應的免疫抑制劑，利用該模型評價環孢素A免疫抑制效果。在移植和給藥后，對移植排斥評分和移植皮膚的存活率進行統計。移植手術4 d和9 d后，ELISA法對血清中IL-4、IL-12 和 IFN-γ的水平進行測定。12 d后，計算胸腺和脾臟系數，對脾臟T細胞中CD4+和CD8+的比例進行分析，同時將移植皮膚進行病理觀察。結果 皮膚移植后，排斥評分逐漸增加，移植皮膚的存活率逐漸下降，有明顯的水腫、炎癥細胞浸潤等炎癥反應。環孢素A可明顯降低移植排斥評分，提高移植皮膚的存活率，使小鼠胸腺和脾臟系數明顯降低，高劑量可明顯降低脾臟T細胞中CD4+和CD8+細胞的比例。同時，環孢素A處理可明顯降低移植皮膚的炎癥反應。結論 小鼠經異種皮膚移植后會出現急性移植排斥反應，環孢素A可有效抑制移植排斥反應，并呈現出明顯的劑量依賴性。

異種皮膚移植；同種皮膚移植；環孢素A；免疫抑制劑；移植排斥評分；移植皮膚存活率

器官移植引起的排斥反應可分為3個階段，即移植物抗原使宿主致敏的感應階段、宿主T細胞被激活的增殖分化階段和移植物被宿主免疫系統攻擊、破壞的效應階段。整個移植免疫應答過程是一個T細胞依賴的免疫反應[1-2]，其中心環節在于T細胞的活化、增殖。針對器官移植引起的排斥反應，臨床上通常會采用免疫抑制劑來進行抗排異治療[3-4]。環孢素A (cyclosporine A，CsA) 是目前應用最為廣泛的免疫抑制劑之一，它可以有效地降低移植患者術后急性排斥反應的發生。環孢素A的免疫抑制效應主要是通過對移植免疫應答中T細胞激活過程的抑制來實現，同時對效應階段和體液免疫也有一定作用。

目前，皮膚移植模型大多采用背部皮膚移植和尾部皮膚移植[5-6]。背部皮膚移植和尾部皮膚移植對于供體皮膚取材的手術要求較高，不同動物之間所取皮膚的均一性較差，且容易感染。本實驗采用耳部皮膚移植到小鼠背部的方法建立皮膚移植模型，具有操作簡單快捷、不同動物間均一性好、不易感染、移植皮膚生長狀態好、易存活等優點，并選用環孢素A作為陽性對照藥，以移植排斥評分、移植皮膚存活率、動物體重變化、皮膚移植小鼠血清中IL-4、 IFN-γ、IL-12的含量、胸腺和脾臟系數、脾臟T細胞中CD4+和CD8+細胞比例以及移植皮膚的病理等為評價指標，對耳-背皮膚移植模型的特點進行分析，同時對環孢素A的藥效進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級BALB/c小鼠55只(♀小鼠25只，♂小鼠30只，其中5只♂小鼠作為同種皮膚移植手術的供體小鼠)，SPF級C57BL/6♂小鼠20只，體質量18～20 g， 購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016 。

1.1.2 藥品與試劑 環孢素A注射液購自諾華制藥有限公司(批號：S0060A)。小鼠IL-4 、IFN-γ和IL-12 ELISA 試劑盒購自美國Sigma公司(批號分別為：0119C0410、0727B0421、0709C0437)。抗小鼠CD4抗體和CD8抗體購自美國BD Biosciences公司(批號分別為3248572、553030)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠皮膚移植模型的建立 根據參考文獻[7]，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠經戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉后，用體積分數為0.75的乙醇對供體小鼠的耳朵和受體小鼠的背部皮膚進行消毒。將供體小鼠的耳朵從根部取下，置于冰冷的無菌PBS中備用。將受體小鼠背部一側皮膚的表皮剪下(直徑約1 cm)，將供體小鼠的耳朵內外側皮膚分離，取內側皮膚，分離面朝下，貼到受體小鼠背部創口處，用剪刀將未完全吻合的皮膚進行剔除修理，接著用無菌創口貼包扎，再用絲線將創口貼縫合固定。4 d后，將創口貼輕輕剪下，暴露移植部位，對移植排斥反應進行評價。在本實驗中，異種皮膚移植(allograft)將C57BL/6小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上，同種皮膚移植(isograft)將BALB/c小鼠皮膚移植到BALB/c小鼠身上。將BALB/c小鼠分為5組，每組10只，♀♂各半，其中4組小鼠接受異種皮膚移植，1組小鼠接受同種皮膚移植。

1.2.2 藥物配制及給藥 移植當天計為d 0，開始給藥，每天1次，直至d 12，將環孢素A注射液根據給藥劑量用生理鹽水進行稀釋。環孢素A高劑量組給藥量為40 mg·kg-1，中劑量為20 mg·kg-1，低劑量為10 mg·kg-1。給藥方式采用尾靜脈注射，空白對照組注射生理鹽水。

1.2.3 移植排斥評分(graft rejection score)和移植皮膚存活率(graft survival rate)的計算

1.2.3.1 移植排斥評分 根據文獻[8]，將移植后皮膚的排斥反應分為0～5級，對應移植排斥評分0～5分(Fig 1、Tab 1)。

Fig 1 Scores to characterize mouse skin graft rejection

A:Score 0;B:Score 1;C:Score 2;D:Score 3;E:Score 4;F:Score 5

Tab 1 Scores to characterize mouse skin graft rejection

Rejection is described as percentage of total graft area. Any artificial lesion, e.g. by the suture or suture material, or any trauma is excluded from evaluation.

1.2.3.2 移植皮膚存活率 當皮膚移植排斥級別達到5級時，我們定義為移植的皮膚死亡，并根據出現5級排斥的動物數量，計算移植皮膚存活率。移植皮膚存活率/%=(每組總動物數-排斥評分5級動物數)/ 每組總動物數×100%。

1.2.4 血清中IL-4、 IL-12和IFN-γ含量的測定 小鼠眼內眥采血，離心取血清，分裝后凍存于-80℃冰箱。測定前，融化后按照ELISA試劑盒的說明書對血清中的IL-4、IL-12和IFN-γ的含量進行測定。

1.2.5 CD4+和CD8+細胞比例分析

1.2.5.1 小鼠脾淋巴細胞分離 迅速脫頸椎處死小鼠，用體積分數為0.75的乙醇浸泡消毒(2～3 min)。在超凈工作臺中，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用Hank’s試劑淋洗1～2次，轉入放有Hank′s試劑的無菌玻璃培養皿中(培養皿冰浴)。將脾臟置于200目篩網上用剪刀剪碎后，倒入Hank′s試劑沖洗，得到脾臟細胞懸液。將細胞懸液離心10 min(1 000 r·min-1)，棄上清，再加入2 mL 裂紅液(ACK lysis buffer)裂解紅細胞3～5 min，加入5 mL RPMI 1640培養液(或者Hank′s試劑)離心10 min(1 000 r·min-1)，沉淀用Hank′s試劑沖洗2次，再用含體積分數為0.1胎牛血清的RPMI 1640培養液調節細胞至所需濃度。

1.2.5.2 CD4+和CD8+細胞計數 將脾淋巴細胞濃度調整為5×109·L-1，取每個待測樣品100 μL，向待測樣品中分別加入2.5 μL CD4抗體、1 μL CD8抗體、2.5 μL CD3抗體，同時設立空白對照組(不加任何抗體)、CD3對照(只加CD3抗體)、CD4對照(只加CD4抗體)、CD8對照(只加CD8抗體)，各對照組需加入一定體積的培養基來保證樣品總體積的一致。混勻后，室溫下避光孵育30 min，用流式細胞儀對CD4+和CD8+細胞數進行測定。

1.2.6 臟器系數計算 小鼠處死后，解剖，取胸腺和脾臟稱重，利用公式：臟器系數=臟器重量(g)/體質量(100 g)，計算臟器系數。

1.2.7 病理組織學檢查 將移植皮膚取下，用體積分數為0.04的甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色后進行病理切片觀察。參考文獻[8]，與皮膚移植排斥評分方法一致，將移植皮膚壞死情況進行病理學評分，評分方法見Tab 2 。

Tab 2 Pathological scores of necrosis and inflammation for evaluation of mouse skin graft rejection

2 結果

2.1 移植排斥評分 由Fig 2可以看出，同種皮膚移植小鼠未出現明顯的移植排斥反應，手術后d 12受體小鼠皮膚生長良好，說明移植手術成功，其他實驗操作對移植皮膚的生長未見明顯影響。空白對照組小鼠d 6開始觀察到移植排斥反應，隨著時間的延長，移植排斥反應評分逐漸增高，在d 12，移植排斥評分基本達到5分。環孢素A可抑制移植排斥反應，與空白對照組相比，40 mg·kg-1環孢素A能有效地抑制移植排斥反應，20 mg·kg-1環孢素A能一定程度地降低移植排斥反應，10 mg·kg-1環孢素A對移植排斥有一定的抑制作用，但抑制作用不明顯。

Fig 2 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft rejection ±s, n=10)

**P<0.01vssaline group

2.2 移植皮膚存活率 由Fig 3所示，同種移植組小鼠皮膚100%存活，說明移植手術成功，各種實驗操作對皮膚移植存活率無明顯影響。異種移植小鼠，d 8開始出現移植皮膚死亡現象，至d 12，異種移植空白對照組小鼠的皮膚全部死亡。給予環孢素A進行治療，每天1次，連續給藥至d 12。結果表明，40 mg·kg-1環孢素A能明顯減少小鼠皮膚移植引起的排斥反應，使移植皮膚的存活率達到100%，20 mg·kg-1環孢素A能使移植皮膚存活率達到83.35%，而10 mg·kg-1的環孢素A能一定程度地抑制因排斥引起的移植皮膚死亡，12 d后移植皮膚存活率為25%。 皮膚存活率是評價免疫抑制劑在皮膚移植手術中抗排斥反應有效性的重要指標。實驗結果表明，高劑量環孢素A免疫抑制作用能達到100%，中劑量環孢素A對移植排斥的抑制效果為83.35%，而低劑量環孢素A雖然能起到一定的免疫抑制作用，但可能并不能達到臨床所需的治療效果。

Fig 3 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft skin survival ±s,n=10)

**P<0.01vssaline group

2.3 動物體重 由Fig 4可以看出，低、中、高劑量的環孢素A連續尾靜脈給藥對♀♂小鼠的生長均存在抑制作用，且存在一定劑量依賴性，其中40 mg·kg-1環孢素A對小鼠生長的抑制作用最為明顯。

2.4 血清中IL-4、 IL-12和IFN-γ含量 IL-4屬于抗炎因子，在器官移植手術中，IL-4的血清水平不應該有明顯的變化。在本實驗中，取手術(給藥)后d 4和d 9的受體小鼠血清，用ELISA試劑盒測定血清中IL-4的含量。結果見Fig 5A，和同種移植組相比，空白對照組小鼠血清中的IL-4均未見明顯增加。同樣，和空白對照組相比，環孢素A各劑量組小鼠血清中的IL-4含量也未出現明顯的變化。

手術(給藥)后d 4，和同種移植小鼠血清中IL-12水平相比，空白對照組小鼠血清中的IL-12含量明顯增加(P<0.01)；10 mg·kg-1的環孢素A在給藥后d 4未能明顯降低血清中IL-12的含量，20、40 mg·kg-1的環孢素A在給藥后d 4均能明顯降低血清中IL-12的含量。在手術(給藥)后d 9,與同種移植組相比，空白對照組小鼠血清中的IL-12明顯增加(P<0.01)，10 mg·kg-1的環孢素A未能明顯降低血清中IL-12的含量，而20 mg·kg-1和40 mg·kg-1的環孢素A在d 9均明顯降低了血清中IL-12的含量(P<0.01)，且劑量依賴性良好(Fig 5B)。

Fig 4 Effects of different doses of cyclosporine A on body weight of male mice (A) and female mice ±s,n=5)

**P<0.01vssaline group

手術(給藥)后d 4，和同種移植組相比，空白對照組小鼠血清中的IFN-γ明顯增加(P<0.01)，環孢素A在低、中、高給藥劑量下均能明顯降低皮膚移植受體小鼠血清中IFN-γ的含量(P<0.01)，且呈現出很好的劑量依賴性。在手術(給藥)后d 9，和同種移植組相比，空白對照組小鼠血清中IFN-γ水平明顯增加(P<0.01)。低、中、高劑量的環孢素A在d 9均能明顯降低小鼠血清中IFN-γ的含量，且存在很好的劑量依賴性(Fig 5C)。

2.5 CD4+和CD8+細胞比例 手術(給藥)后d 12，取脾細胞進行CD4+細胞計數，與同種移植組小鼠CD4+細胞百分比相比，異種移植組小鼠未見明顯變化，給藥后3個劑量組的CD4+細胞比例也無明顯差別(Fig 6A)。對于CD8+細胞，在手術(給藥)后d 12，與同種移植組小鼠相比，空白對照組小鼠脾臟CD8+細胞比例明顯增加(P<0.05)。40 mg·kg-1環孢素A組小鼠脾臟CD8+細胞比例較空白對照組明顯降低(P<0.05)，10、20 mg·kg-1環孢素A劑量組小鼠脾臟CD8+細胞出現下降的趨勢，但差異無顯著性(Fig 6B)。

2.6 胸腺、脾臟系數 手術(給藥)后d 12，和同種皮膚移植組小鼠相比，空白對照組小鼠胸腺系數無明顯增加。隨著環孢素A劑量的增加，小鼠胸腺系數逐漸減小，并呈現劑量依賴性，但和空白對照組相比差異均無顯著性(Fig 7A)。和同種皮膚移植組小鼠相比，空白對照組小鼠脾臟系數有一定程度的增加，但差異無顯著性。隨著環孢素A劑量的增加，小鼠脾臟系數逐漸減小，并呈現劑量依賴性，但和空白對照組相比，差異均無顯著性(Fig 7B)。

2.7 移植皮膚病理 手術(給藥)后d 12，將移植皮膚取下，石蠟包埋切片，HE染色后，進行病理學觀察，并進行皮膚壞死程度評分。如Fig 8所示，空白對照組和10 mg·kg-1環孢素A給藥組移植皮膚組織表皮下見一細長伊紅色條狀異物與表皮平行排列分布，異物中間充滿大量大小不一的圓形空白結構。異物上方皮下結締組織中有大量炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞和部分中性粒細胞，組織水腫疏松，上方表皮層鱗狀細胞基本壞死(>95%)，部分脫落形成表皮潰瘍。異物下方有較多炎癥細胞沿異物呈帶狀集聚，局部有灶性炎癥細胞壞死，形成微小膿腫，中央壞死使組織分離呈小空腔。在下方深部皮下脂肪結締組織及肌層有較大量炎癥細胞廣泛浸潤。20 mg·kg-1環孢素A給藥組移植皮膚組織也存在長條狀異物，異物上下兩側皮下組織有部分淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，組織結構疏松。兩端表皮鱗狀細胞層尚保存，中間局部上皮也存在壞死脫落潰瘍(>50%)，但相對于空白對照組和低劑量環孢素A給藥組，脫落潰瘍程度較輕。40 mg·kg-1環孢素A給藥組和同種皮膚移植組移植皮膚組織皮下長條狀異物不明顯，異物上下兩側皮下組織有輕度炎癥細胞浸潤或者無炎癥細胞浸潤，組織結構較緊密，表皮鱗狀細胞層完整保存。 對皮膚壞死程度進行病理評分，如Fig 9所示，同種移植組和40 mg·kg-1環孢素A給藥組移植皮膚病理評分較低，移植皮膚無明顯壞死，與空白對照組相比，差異存在顯著性。

The isolated splenic cells with low concentration(less than 5×109·L-1) were excluded from the analysis.*P<0.05vssaline group;#P<0.05vsisograft group.

Fig 7 Effects of different doses of cyclosporine A on thymus index (A) and spleen index ±s,n=10)

Fig 8 Effects of cyclosporine A on pathology of graft skin(×100)

A:Saline;B:10 mg·kg-1CsA; C:20 mg·kg-1CsA; D:40 mg·kg-1CsA; E:Isograft

Fig 9 Effects of cyclosporine A on pathological scores

**P<0.01vssaline group

3 討論

器官移植是現代醫學治療的重要手段之一，臨床常見的移植器官有腎、肝、心、角膜移植、胰腺與胰島、甲狀旁腺、骨髓等[9-10]。免疫抑制劑在臨床上廣泛應用，極大地推動了器官移植的實施并提高了移植物的存活率，改善了患者的生存質量，同時也為許多自身免疫性疾病的治療開辟了廣闊的應用前景[11]。然而，目前免疫抑制劑在應用過程中仍然存在毒副作用廣泛且強烈，治療對象和方案較局限的缺點。器官移植治療對免疫抑制劑在防治急、慢性排斥反應、減少毒副作用方面提出了更高要求，因此，尋求高效低毒的藥物是研究新型免疫抑制劑的目標。

本實驗采用耳部皮膚移植到小鼠背部的方法建立了皮膚移植模型，并利用該模型對環孢素A的免疫抑制作用進行了評價。本模型中的皮膚移植手術操作簡單快捷，大大減少了對動物的損傷，同時降低了感染的風險。同種移植皮膚100%存活且移植皮膚生長良好，幾乎無炎癥細胞浸潤。對陽性對照藥環孢素A的藥效學評價結果表明，該模型可有效地體現環孢素A的免疫抑制作用，40 mg·kg-1的環孢素A可有效抑制免疫排斥反應，該劑量和環孢素A臨床試驗劑量相當，免疫抑制結果和臨床結果吻合。同時，在本模型中，環孢素A明顯抑制動物體重的增長，并呈現出劑量依賴性，對脾臟和胸腺也存在抑制作用，說明本模型不僅能有效地反映環孢素A的免疫抑制藥效，也充分地暴露了環孢素A的副作用。

總之，本實驗中建立的小鼠皮膚移植模型具有操作簡單，手術成功率高，實驗均一性好的優點，在有效反映免疫抑制劑藥效的同時又可充分暴露藥物的副作用，不失為免疫抑制劑篩選和評價的可靠模型。

(致謝：本實驗是在中國醫藥工業研究總院藥理評價研究中心完成。在此，向所有幫助過我的人表示最衷心的感謝！)

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Establishment of an allogenetic skin transplant model in mice for evaluating immunosuppressive drugs

CAI Chun-xiao1,2,3, MA Chun-mei1,2,3, MENG Li-zheng1,2,3,TIAN Hua-jie1,2,3, HUANG Xiao-xing1,2,3, LIU Li1,2,3, MEI Qi-bing1,2,3

(1.CenterforPharmacologicalEvaluationandResearch,ChinaStateInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200040,China;2.ShanghaiProfessionalandTechnicalServiceCenterforBiologicalMaterialDruggabilityEvaluation,Shanghai200437,China;3.StateKeyLaboratoryofNewDrugandPharmaceuticalProcess,ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200437,China)

Aim To establish an allogenetic mouse skin transplant model,in order to provide a research model for immunosuppressive drugs.Methods Skins from the ears of C57BL/6 mice were transplanted to the back of BALB/c mice and skin isografts(BALB/c mice to BALB/c mice) were used as control.Cyclosporin A(CsA) was used as a model compound to test the immnosuppresive effect on allogenetic graft rejection.Following the transplation and CsA treatment, the graft rejection score and graft skin survival rate were quantified.Four and nine days after transplantation,serum IL-4,IL-12 and IFN-γ levels were measured using ELISA kits.Twelve days after transplantation, mice were sacrificed.The weight of spleen and thymus was obtained, and CD4+and CD8+population of spleenic T cells were analyzed using flow cytometer.Histological features were assessed by hematoxylin-eosin(HE) staining of formalin-fixed, paraffin-embedded graft skins.Results After transplantion, the graft rejection score increased and graft skin survival rate decreased graduallly. Serum IL-12 and IFN-γ levels of allograft mice increased markedly. Compared with those of isograft mice, mice with skin allograft displayed a significant increase in the percentage of the CD8+T cell subpopulation. Remarkable inflammation, such as edema, inflammatory cell infiltration were observed in allograft mice. Compared with saline treated mice, CsA significantly reduced the graft rejection score and improved survival rate of skin grafts. And also, CsA treated mice had smaller spleen and thymus. Mice that received high doses of CsA had significantly less CD8+T cells than those treated with saline. Moreover, allograft skins in mice that received CsA had less inflammation.Conclusions Allogenetic mouse skin transplantation exhibits acute graft rejection. CsA can inhibit the rejection in a dose dependent manner.

allogenetic skin transplantation；isogenetic skin transplantation；cyclosporin A；immunosuppressive drugs；graft rejection score；graft skin survival rate

2016-08-17，

2016-09-13

上海市生物物質成藥性評價專業技術服務平臺項目(No 15DZ2291700)

蔡春曉(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學,E-mail: caichunxiao217@sina.com；

劉 莉(1967-)，女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：中藥調節免疫及中藥預防治療消化系統疾病，通訊作者，E-mail: liuli1129@hotmail.com；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.050.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.025

A

1001-1978(2016)11-1613-07

R-332；R392.12；R622.1；R979.5

梅其炳(1953-)，男，博士，研究員，博士生導師，研究方向：心腦血管藥理學，通訊作者，E-mail: qbmei@fmmu.edu.cn