利用C6膠質瘤干細胞建立小鼠腦膠質瘤模型及評價

王亞華，徐浩倫，閆荷露，李 霞，應 雪

(新疆石河子大學藥學院特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

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利用C6膠質瘤干細胞建立小鼠腦膠質瘤模型及評價

王亞華，徐浩倫，閆荷露，李 霞，應 雪

(新疆石河子大學藥學院特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

目的 利用C6膠質瘤干細胞建立ICR小鼠動物模型，為深入研究膠質瘤干細胞在腦膠質瘤中的作用提供理想的模型。方法 采用懸浮生長法體外培養C6膠質瘤干細胞，用Nestin巢蛋白抗體進行鑒別；利用C6干細胞建立ICR小鼠腦膠質瘤模型，考察小鼠術后的生存狀態和腫瘤體積變化；通過HE染色及CD133免疫組化考察小鼠術后的病理學變化。結果 C6膠質瘤干細胞中Nestin表達量為96.01%，Nestin在所培養的C6膠質瘤干細胞球中高表達；小鼠接種腫瘤后食欲不振，體質量偏輕，且行為緩慢，反應呆滯；建模21 d時腫瘤體積為(9.77±6.58)mm3；模型經HE染色后可見腦組織呈浸潤性生長，腫瘤細胞核皺縮，排列紊亂；免疫組化CD133染色顯示腫瘤細胞胞質顯棕色，腫瘤組織中存在大量的腦膠質瘤干細胞。結論 利用膠質瘤干細胞建立的腦膠質瘤模型成瘤率高，成瘤周期短，可作為后期腦膠質瘤模型的理想模型。

ICR小鼠；腦膠質瘤；動物模型；膠質瘤干細胞；鑒別；CD133染色

腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs) 是構成腫瘤實體的異質細胞群中含有的一些擁有自我更新能力以及分化能力的細胞群體[1]。目前，臨床主要通過腫瘤細胞減少的數量以及腫瘤體積縮小的程度來評價手術或者化療和化療對腫瘤的治療作用[2]。但是根據腫瘤干細胞理論，目前這種評價方法不能代表腦腫瘤能否完全清除。采用臨床手段治療后，如果腫瘤干細胞繼續增殖，腦腫瘤有繼續復發的可能。所以，如果能完全清除腫瘤組織中的腫瘤干細胞，腦腫瘤就有被根治的可能。因此，本實驗擬采用C6膠質瘤干細胞建立小鼠膠質瘤模型，考察腫瘤干細胞在腦膠質瘤形成過程中的生長情況與病理學特征，為后續研究腦腫瘤模型建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 C6膠質瘤細胞購自中國科學院上海細胞庫；ICR(imprinting control region)♂小鼠，購自新疆醫科大學；基本成纖維細胞生長因子(bFGF)與表皮生長因子(EGF)(中科邁晨科技有限公司)； DMEM/F12(美國Gibco公司)；Nestin巢蛋白抗體(美國R&D公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；0.25% 胰酶(美國Gibco公司)； FACScan流式細胞儀(美國BD公司)；山羊抗兔抗體(中杉金橋生物科技有限公司)；B27因子(美國Gibco公司)；CD133抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 C6膠質瘤干細胞的培養 將C6細胞系接種于10%胎牛血清的培養基中，在CO2飽和濕度培養箱中培養48 h后，用PBS清洗，0.25%胰酶消化，吹打成單細胞懸液，重懸于由DMEM/F12、10 μg·L-1bFGF、20 μg·L-1EGF、體積分數為0.02的B27因子組成的無血清培養基中，待腦腫瘤干細胞增殖形成腫瘤干細胞球。

1.2.2 C6膠質瘤干細胞的鑒定 收集C6膠質瘤干細胞球，采用胰酶消化，PBS 清洗細胞，4%的多聚甲醛固定10 min。體積分數為0.001的皂苷破膜，與Nestin巢蛋白抗體以及其同型對照一起避光孵化30 min，洗滌3次后用PBS重懸，使用FACScan流式細胞儀分析。

1.2.3 小鼠腫瘤模型的建立 取腫瘤干細胞球，用PBS重懸吹打至腫瘤球分散均勻，用計數板調整干細胞濃度為5×1010·L-1，將分散均勻的干細胞置于37℃水浴鍋中備用。取體質量在18～20 g的ICR ♂小鼠，用體積分數為0.2的氨基甲酸乙酯1 g·kg-1麻醉，將小鼠固定于腦立體定位儀上。頭頂備毛，分離暴露顱骨。根據小鼠頭部解剖圖譜確定冠狀縫前0.4 mm，矢狀縫向右2 mm，牙科鉆鉆孔。用微量注射器抽吸3 μL含有5×1010·L-1干細胞混懸液，沿骨孔緩慢垂直進針至硬腦膜下3.0 mm，固定。緩慢注射1μL干細胞混懸液(1 min)，留針1 min，緩慢拔針，骨蠟封閉骨窗。肌注青霉素，常規單籠飼養。

1.2.4 腫瘤模型的評價 ① 觀察小鼠術后的生存狀態；② 測量腫瘤體積變化：小鼠接種腫瘤干細胞后，分別將接種成功后的d 7、14、21的小鼠，用10%的多聚甲醛固定腫瘤標本，沿小鼠腦表面接種點做冠狀切口，測量腫瘤體積的大小，腫瘤體積=a2bπ/6(a為腫瘤的短徑，b為腫瘤的長徑)；③ 組織學檢查：取腦膠質瘤標本經過石蠟包埋切片后，分別進行HE染色及CD133免疫組化染色。

2 結果

2.1 C6干細胞的鑒定 C6細胞接種于無血清干細胞培養基，培養14 d后，可形成干細胞腫瘤球體，且腫瘤球折光性強，干細胞腫瘤球生長過程較為緩慢， 6～7 d可以進行傳代培養。通過FACScan流式細胞儀分析，由Fig 1可知，與同型對照相比，C6膠質瘤干細胞中Nestin表達量占96%。從結果中可以看出Nestin在所培養的C6膠質瘤干細胞球中高表達，說明上述培養條件適合干細胞的生長和增殖。

Fig 1 Identification of glioma stem cells(GSCs)

A: GSCs treated as isotype controls; B: GSCs stained with anti-mouse/rat nestin-phycoerythrin antibodies.

2.2 小鼠術后基本情況觀察 接種C6膠質瘤干細胞1周后，發現小鼠食欲不振，體質量偏輕，一些小鼠有不自覺的逆時針轉圈習慣，體格較弱，喜縮成一團，且行為緩慢，反應呆滯，眼睛半瞇，無神，卷縮近不動，且體溫低于正常組小鼠。接種干細胞后，小鼠的中位生存期為19 d，最長生存時間為26 d。

2.3 腫瘤體積變化 接種干細胞d 7、14、21時，測定腫瘤的體積分別為(0.51±8.67) mm3、(4.88±5.90) mm3、(9.77±6.58) mm3。由結果可知，腫瘤體積隨著天數的增加逐漸增大。當建模d 21時，腫瘤體積與建模d 7和d 14相比差異有顯著性(P<0.05)。

2.4 組織學檢查 由Fig 2可知，腫瘤組織邊緣無明顯邊界，呈浸潤性生長狀態，腫瘤細胞核皺縮，排列紊亂。在腫瘤組織中，有大面積的壞死和出血區域，并分布有豐富的微血管。由Fig 3可知，免疫組化CD133染色顯示腫瘤細胞有棕色陽性顯色，且為胞質著色，說明腫瘤組織中存在有大量的腦膠質瘤干細胞。

3 討論

腦膠質瘤是人類死亡率最高的腫瘤之一，其具有浸潤性生長的特點，且腦腫瘤邊緣無明顯邊界。盡管接受手術、放療、化療等手段，膠質母細胞瘤患者的預后仍然很差，而且神經膠質瘤對放療和化療藥物的敏感性較差。由于腦腫瘤干細胞的存在，腦腫瘤的復發率也較高，因此腦腫瘤的預后也不理想[3-4]。因此，本實驗建立了將腦腫瘤干細胞接種到小鼠腦內的膠質瘤模型，為后續膠質瘤實驗的研究奠定基礎。

Fig 2 HE staining of tumor tissue(×100)

Fig 3 Tumor immunohistochemical staining CD133 positive(×200)

ICR小鼠[5]是Hauschka用Swiss小鼠群以多產為目標，進行選育的小鼠。ICR小鼠具有較強的適應性，且生長速度較快，具有較好的實驗重復性。ICR小鼠是進行免疫藥物篩選，復制病理模型較常用的實驗動物，已廣泛用于藥理、毒理、腫瘤等的研究[6-7]。因此，本研究中選用ICR小鼠造模，相比較于使用大鼠造模，模型成功率高，且便于操作。將C6干細胞接種到小鼠組織中，相比較用C6細胞構建腫瘤模型，C6干細胞較C6細胞具有更強的浸潤性以及促進腫瘤細胞生長的能力，可以更好地研究腫瘤干細胞在腫瘤生長過程中的生物學特性，為后續腫瘤復發的研究提供依據。

如何從腫瘤細胞中分離純化腫瘤干細胞，也是目前的主要研究內容之一。針對腦腫瘤干細胞的分離及純化主要有以下幾種方法，即CD133免疫磁珠法、懸浮生長法、SP細胞鑒定法[8]。CD133免疫磁珠法或者SP細胞操作方法復雜，成本較高，且在獲得過程中細胞數量的損耗較多，只能較少地反映干細胞的特性，而懸浮生長法可以在短時期內獲得較多以及符合建模要求的干細胞，因此本研究中選用懸浮生長法來培養單克隆C6膠質瘤干細胞球。在本實驗中，采用流式細胞儀用Nestin巢蛋白抗體對C6干細胞進行了鑒別。由鑒別結果可知，C6干細胞的表達量較多，達到了實驗的要求。

在造模過程中，分離暴露顱骨以后，應注意保持傷口的潤濕性，防止傷口干燥，影響小鼠后期的恢復。在注射C6干細胞的過程中，緩慢注射1 μL，留針1 min，防止干細胞在迅速拔針的過程中遺失，使細胞可以在靶部位充分沉積，延長腫瘤干細胞與靶點腦組織的接觸時間，從而提高成瘤率[3]。

CD133是人類造血干細胞上的一種跨膜糖蛋白。近年來研究發現，CD133在白血病細胞、腦膠質瘤、結腸癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中均有表達[9-11]，表明呈CD133陽性的腫瘤細胞具有很強的增殖、分化以及自我更新的能力，是研究腫瘤干細胞表面標記物的重要指標之一。在本研究中，免疫組化選用CD133作為一抗(1 ∶50)，山羊抗兔作為二抗，結合HE染色可知，腫瘤組織邊緣呈浸潤性生長，且腫瘤組織中有大面積的壞死和出血區域，CD133在細胞質中大量表達。說明采用此方法建立的腫瘤模型成功。

綜上所述，本研究中使用C6懸浮生長法提取了C6干細胞，利用C6膠質瘤干細胞建造了小鼠腫瘤模型，此方法成瘤周期短且具有較高的成瘤性。通過建立腫瘤干細胞腦膠質瘤模型，將對研究腦腫瘤產生的原因、腫瘤干細胞在成瘤過程中的作用機制、腦膠質瘤的發病原因和預防產生較大的影響。同時，本研究可為膠質瘤干細胞在膠質瘤中的分子機制以及作用機制研究提供理想的模型。

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Establishment of mice model of C6 glioma stem cells and its evaluation

WANG Ya-hua, XU Hao-lun, YAN He-lu, LI Xia , YING Xue

(KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832000,China)

Aim To establish ICR animal model with C6 glioma stem cells, to provide the ideal model for the further study of glioma stem cells in brain glioma model.Methods C6 glioma stem cell was culturedinvitroby suspension,and was identified with Nestin antibody. C6 stem cells of ICR mouse glioma model were used to investigate survival state and tumor volume in mice after the operation. HE staining and CD133 immunohistochemical study were adopted to investigate the postoperative pathological changes in mice.Results The expression of Nestin was 96.01% in C6 glioma stem cells, and Nestin was highly expressed in the cultured C6 glioma stem cells. Mice were inoculated with tumor after loss of appetite, weight, behavior and slow, sluggish reaction. Tumor volume at day 21 after modeling was (9.77±6.58) mm3. After HE staining, the model showed the invasive growth, tumor cell shrinkage and derangement. Immunohistochemical CD133 staining revealed that tumor cytoplasm color was brown.Conclusion Glioma model can be established based on glioma stem cells into a high rate of tumor, the tumor cycle is short, which can be used as an ideal model for glioma.

ICR mice; brain glioma; animal model; C6 glioma stem cells; identification; CD133 staining

2016-07-05，

2016-08-10

國家自然科學基金資助項目(No 81160396，81460540)；石河子大學杰出青年科技人才培育計劃項目(No 2012ZRKXJQ07)；新疆生產建設兵團社會發展科技攻關與成果轉化計劃項目(No 2015AD007)

王亞華(1992-)，女，碩士生，研究方向：藥物新劑型， E-mail：630579054@qq.com；

應 雪 (1981- )，女，博士，副教授，研究方向：藥物新制劑與新劑型，通訊作者，Tel:0993-2057939,E-mail：yingxueshzu@163.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.026

A

1001-1978(2016)11-1620-03

R-332；R329.2；R363-332；R394.2；R730.264；R739.41