TLR4信號通路在高糖誘導骨髓來源巨噬細胞激活中的作用

張婷敏，邵云俠，徐興欣，王 坤，吳永貴

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TLR4信號通路在高糖誘導骨髓來源巨噬細胞激活中的作用

張婷敏，邵云俠，徐興欣，王 坤，吳永貴

目的 通過研究高糖對骨髓來源巨噬細胞(BMDM)Toll受體4(TLR4)表達及其下游信號通路的影響，初步探討高糖通過TLR4信號通路促進巨噬細胞分泌炎癥因子的機制。方法 分離獲取C57BL/6J及B10ScNNju(TLR4基因敲除小鼠)BMDM，流式細胞儀檢測其純度；選取不同濃度的高糖及甘露醇，在不同時間點刺激BMDM；后將BMDM分為4組：正常糖濃度(LG)組、高糖刺激(HG)組、TLR4基因敲除(TLR4-/-)組、TLR4基因敲除BMDM高糖刺激(TLR4-/-+HG)組。采用流式細胞術觀察BMDMM1表型，細胞免疫熒光法觀察BMDMTLR4與誘生型一氧化氮合酶(iNOS)共表達，實時定量PCR法檢測各組細胞中促炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、白細胞介素1β(IL-1β)及iNOS的mRNA表達，Westernblot法檢測各組總蛋白中TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)、TIR結構域銜接蛋白(Trif)、磷酸化白介素受體相關激酶-1(p-IRAK-1)、干擾素調節因子3(IRF3)、磷酸化(p)-IRF3、核因子κB(NF-κB)p65、NF-κBp-p65、iNOS蛋白的表達，ELISA法測定細胞上清液中促炎因子TNF-α、MCP-1、IL-1β的表達。結果 與LG組比較，高糖可使M1型巨噬細胞百分比增加；TNF-α、MCP-1、IL-1β及iNOS的mRNA水平上調；TLR4、MyD88、Trif、p-IRAK-1、p-IRF3、IRF3、NF-κBp65、NF-κBp-p65、iNOS蛋白表達水平升高；細胞培養基中分泌的TNF-α、MCP-1、IL-1β水平升高。TLR4基因敲除可消除高糖導致的巨噬細胞激活效應。結論 高糖可誘導BMDM向M1型極化；TLR4基因敲除可抑制高糖誘導的巨噬細胞向M1活化及炎癥因子的產生。

骨髓來源巨噬細胞；Toll受體4；高糖；炎癥

糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病患者常見的微血管并發癥之一，研究[1]顯示慢性炎癥狀態在DN的病程起了重要作用。巨噬細胞是炎性反應中主要的調節細胞，在DN早期腎組織中已有巨噬細胞的浸潤，激活后分泌細胞因子、炎癥介質，產生氧自由基等[2]，造成腎組織結構和功能的損傷。DN的病程中巨噬細胞如何浸潤、激活一直是中外學者密切關注和研究的焦點。研究[3]顯示Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)家族成員Toll受體2(Toll-likereceptor2,TLR2)和Toll受體4(Toll-likereceptor4,TLR4)很有可能是聯系糖尿病患者天然免疫系統和微血管炎癥反應的關鍵。但關于TLRs受體在糖尿病腎病中如何被激活，作用于何種細胞，引起炎癥反應并沒有清楚的認識。高血糖是DN發生、發展的先決條件，該實驗在體外骨髓來源巨噬細胞(bonemarrow-derivedmacrophages，BMDM)中以高糖刺激模擬糖尿病微環境，假定TLR4與其內源性配體結合，激活下游信號通路TLR4、髓樣分化因子88(myeloiddifferentiationprimaryresponsegene88，MyD88)、TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containingadapter-inducinginterferon-β，Trif)、磷酸化白介素受體相關激酶-1(phospho-IL-1receptor-associatedkinase-1，p-IRAK-1)、干擾素調節因子3(interferonregulatoryfactor3，IRF3)、核因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)，產生損傷介質如腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)、單核細胞趨化因子-1(monocytechemoattractantprotein1，MCP-1)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)等，使巨噬細胞極化為M1型。為下一步探討阻斷巨噬細胞TLR4信號通路激活途徑防治DN提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 6～8周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠及B10ScNNju(TLR4基因敲除)小鼠，18～20g，由南京大學模式動物研究所提供。L929小鼠成纖維細胞細胞株(中科院上海細胞庫)；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)(加拿大WISENT公司)；D-葡萄糖、甘露醇(美國Sigma公司)；FITC標記抗小鼠F4/80抗體、APC標記抗小鼠CD11b抗體、PE標記抗小鼠CD11c抗體(美國BioLegend公司)；TRIzol試劑(美國LifeTechnology公司)；反轉錄試劑盒(美國Promega公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(美國Bio-Rad公司)；實時熒光定量PCR引物(上海生工、美國GeneCopoeia公司)；兔抗TLR4、兔抗MyD88、兔抗Trif、兔抗誘生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)多克隆抗體(美國Abcam公司)；兔抗p-IRAK1多克隆抗體(美國SantaCruz公司)；兔抗p-IRF3、兔抗IRF3、兔抗NF-κBp-p65、兔抗NF-κBp65多克隆抗體(美國CST公司)；小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG(武漢三鷹生物技術公司)；ECL增強化學發光試劑盒(美國ThermoScientific公司)；流式細胞儀(美國BD公司，FACSCalibur)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司，TCSSP5)。

1.2 方法

1.2.1BMDM分離、培養及鑒定 頸椎脫臼法處死小鼠后，75%乙醇浸泡5min，分離股骨和脛骨，70%乙醇浸泡3min；移入超凈臺剪開骨兩端，用含2%FBS的預冷PBS5～6ml沖出骨髓細胞，過細胞篩，紅細胞裂解液去除紅細胞，2 290r/min離心5min，棄上清液，用含有15%L929細胞培養液、10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養基重懸，調整細胞濃度至1×106個/ml，接種至6孔板，于5%CO2、37 ℃孵箱中培養，第7天時收獲細胞，流式細胞儀F4/80和CD11b雙標記陽性為成熟BMDM。

1.2.2 實驗條件優化 使用不同濃度葡萄糖刺激成熟BMDM，甘露醇補充使培養基滲透壓濃度相同，以排除滲透壓對實驗的影響。收集細胞，提取總蛋白，選取TLR4、iNOS蛋白表達上調最高的葡萄糖刺激濃度，作為后續實驗中的高糖刺激濃度。采取同一濃度高糖刺激BMDM，選取不同時間點收集細胞，提取總蛋白，觀察TLR4、iNOS蛋白表達，以確定高糖刺激最佳時間。將BMDM分為4組：正常糖濃度(LG)組、高糖刺激(HG)組、TLR4基因敲除(TLR4-/-)組、TLR4基因敲除BMDM高糖刺激(TLR4-/-+HG)組。

1.2.3 細胞免疫熒光 取1×105個BMDM接種于Petri皿中，預冷4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，每次5min， 4 ℃條件下，加入5%驢血清阻斷2h，PBS漂洗2遍，加入抗iNOS和抗TLR4的一抗，4 ℃過夜，PBS洗滌后，分別加入一抗對應的標記為PE和FITC的二抗，避光孵育2h。PBS洗滌后，用DAPI進行細胞核染色，然后將細胞放在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細胞術檢測各組BMDMM1型活化百分比 用抗小鼠CD16/CD32受體阻斷抗體孵育30min封閉BMDM膜上Fc受體，然后加入FITC標記的抗小鼠F4/80 抗體，APC標記的CD11b和PE標記的CD11c抗體，4 ℃避光孵育30min，2 500r/min離心10min，棄上清液，重懸于500μlPBS中混勻，流式細胞儀檢測F4/80、CD11b和CD11c標記均為陽性的細胞(DeNovoSoftware公司的FCSExpress4.0)，計算陽性巨噬細胞百分比。

1.2.5Westernblot法檢測細胞蛋白表達 收集各組細胞，冰上裂解后提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定各組蛋白濃度。每個蛋白樣品取40μg上樣，經8%～12%SDS-PAGE電泳，恒流轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2h，加一抗TLR4(1 ∶1 000)、MyD88(1 ∶250)、Trif(1 ∶500)、p-IRAK-1(1 ∶200)、p-IRF3(1 ∶1 000)、IRF3(1 ∶1 000)、NF-κBp-p65(1 ∶1 000)、NF-κBp65(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶35 000)，4 ℃過夜，PBST洗膜3次，每次10min，加入辣根過氧化物酶標記二抗(1 ∶8 000)，37 ℃孵育45min，將ECL發光試劑盒中的A、B液等體積混合，用移液槍反復滴于膜上，反應30s后，放入AI600化學發光凝膠成像成像系統中顯影。用IQTL8.1軟件對Westernblot條帶進行半定量分析。以β-actin條帶和目的條帶積分光密度(opticaldensity,OD)值比值均值作為每組的結果。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測各組細胞mRNA的表達 使用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，紫外分光光度法檢測RNA純度，要求OD260 nm/OD280 nm比值在1.8～2.0，后以RNA為模板反轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR采用SYBRGreen法，GAPDH引物序列上游引物：5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′；下游引物：5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′。TNF-α引物序列上游引物：5′-CCCTCCTGGCCAACGGCATG-3′；下游引物：5′-TCGGGGCAGCCTTGTCCCTT-3′。下列引物由GeneCopoeia公司合成：MCP-1：貨號MQP027672；IL-1β：貨號MQP027422；iNOS：貨號MQP029793。其反應條件為：95 ℃預變性10min，進入循環；95 ℃變性15s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，擴增35 個循環；最后72 ℃延伸7min。每個樣本重復3次，采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。

1.2.7ELISA法檢測各組巨噬細胞培養基中細胞因子含量 實驗結束后吸取各組巨噬細胞培養基，5 000r/min, 4 ℃離心10min，吸取上清液，-80 ℃保存。按照ELISA試劑盒說明書測定培養基中TNF-α、IL-1β、MCP-1的含量。

2 結果

2.1BMDM誘導分化及鑒定 流式細胞術鑒定BMDM，FITC標記的抗小鼠F4/80、APC標記的抗小鼠CD11b。BMDM純度達到99.18%。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測BMDM的純度

CD11b示巨噬細胞的成熟度；F4/80示巨噬細胞的表面標志物

2.2BMDM不同高糖刺激濃度、不同刺激時間點TLR4及iNOS的表達 為優化實驗條件，使用20、25、30、35mmol/L4個糖濃度刺激BMDM，并使用甘露醇做滲透壓對照，Westernblot結果提示在糖濃度為25mmol/L時TLR4表達升高，但在30mmol/L時(0.69±0.02)升高最明顯(F=128.334, P<0.05)；糖濃度為20mmol/L即可使iNOS表達升高，糖濃度在30mmol/L時(0.67±0.03)升高最明顯(F=89.259, P<0.05)。見圖2。隨后在8個刺激時間點，0、0.5、1、2、4、6、12、24h收集BMDM，Westernblot結果提示TLR4在刺激1h即開始升高，24h(0.67±0.01)達到高峰(F=159.263, P<0.05)；iNOS在刺激6h開始升高，24h(0.69±0.01)達到高峰(F=52.853, P<0.05)。見圖3。后續實驗選擇30mmol/L糖濃度做為培養基葡萄糖終濃度，刺激時間24h做為實驗終點。

2.3 高糖刺激BMDMM1型活化及TLR4基因敲除的影響 激光共聚焦顯微鏡下觀察HG組TLR4及M1型巨噬細胞特異性標志物iNOS熒光強度明顯高于LG組，而TLR4基因敲除后可使iNOS熒光強度明顯減弱，見圖4。流式細胞儀檢測F4/80、CD11b和CD11c陽性的M1 型巨噬細胞結果顯示，HG組M1 型巨噬細胞比例比LG組顯著升高(P<0.05)；與HG組比較，敲除TLR4基因后M1型巨噬細胞比例顯著降低(P<0.05)，各組間差異有統計學意義(F=475.454, P<0.05)。見圖5。

圖2 不同高糖濃度刺激BMDM對TLR4和iNOS表達的影響

圖3 不同刺激時間點對BMDM TLR4和iNOS表達的影響

圖4 激光共聚焦檢測高糖對BMDM的活化作用 ×400

圖5 流式細胞術檢測高糖對BMDM的活化作用

A：LG組；B：HG組；C：TLR4-/-組；D：TLR4-/-+HG組；與LG組比較：*P<0.05,**P<0.01；與HG組比較：##P<0.01

2.4 高糖刺激對TLR4信號通路及iNOS的影響Westernblot結果顯示，與LG組比較，HG組TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、IRF3、NF-κBp-p65、NF-κBp65及iNOS蛋白表達均升高(P<0.05)；而與HG組比較，TLR4基因敲除可顯著抑制TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、IRF3、NF-κBp-p65、NF-κBp65及iNOS蛋白的表達(P<0.05)。各指標組間差異有統計學意義(FTLR4=655.171,FMyD88=844.074,Fp-IRAK-1=335.537,FTrif=247.578,Fp-IRF3=171.421,FIRF3=179.654,FNF-κB p-p65=800.409, FNF-κB p65=181.135, FiNOS=188.658, P<0.05)。見圖6。

圖6 Western blot法檢測和光密度分析高糖刺激BMDM細胞對TLR4信號通路及iNOS的影響

A：TLR4、MyD88、p-IRAK-1、Trif蛋白表達；B：p-IRF3、IRF3、NF-κBp-p65、NF-κBp65及iNOS蛋白表達；1：LG組；2：HG組；3：TLR4-/-組；4：TLR4-/-+HG組；與LG組比較：**P<0.01；與HG組比較：##P<0.01

2.5 高糖刺激對TNF-α、IL-1β、MCP-1和iNOSmRNA表達的影響 實時熒光定量PCR結果顯示，與LG組比較，HG組TNF-α、IL-1β、MCP-1 和iNOSmRNA水平均明顯上調(P<0.05)。而與HG組比較，TLR4基因敲除可使TNF-α、IL-1β、MCP-1 和iNOSmRNA水平不同程度降低(P<0.05)。各指標組間差異有統計學意義(FTNF-α=1 119.907, FIL-1β=1 047.669, FMCP-1=797.689, FiNOS=1 251.348, P<0.05)。見圖7。

圖7 高糖刺激對TNF-α、IL-1β、MCP-1 和iNOS mRNA 表達的影響

A：LG組；B：HG組；C：TLR4-/-組；D：TLR4-/-+HG組；與LG組比較：*P<0.05,**P<0.01；與HG組比較：##P<0.01

2.6 高糖刺激對BMDM培養基中分泌TNF-α、IL-1β、MCP-1的影響ELISA結果顯示，與LG組比較，HG組細胞培養基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌水平均明顯上調(P<0.05)。而與HG組比較，TLR4基因敲除可使培養基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌水平不同程度降低(P<0.05)。各指標組間差異有統計學意義(FTNF-α=77.556, FIL-1β=238.684, FMCP-1=1 117.901,P<0.05)。見圖8。

3 討論

DN作為最常見的糖尿病微血管并發癥，具體發病機制尚不明確。研究[4]表明，其發生發展可能與遺傳背景、血流動力學改變、氧化應激、免疫以及炎癥反應有關，而炎癥作為主要的影響因素，近些年來受到越來越多的關注。巨噬細胞是主要的炎癥細胞，其在腎臟內浸潤是DN炎癥反應公認的特點，Nguyenetal[5]在糖尿病患者腎活檢組織中發現腎小球和間質存在巨噬細胞浸潤，且浸潤程度與后期腎功能下降率呈正相關性。糖尿病動物模型中腎組織巨噬細胞浸潤較對照組明顯增加[6]，而抑制巨噬細胞游走抑制因子的表達，可抑制巨噬細胞激活，減少炎癥因子的釋放，降低尿白蛋白排泄率，從而延緩DN的發展[7]。研究[8]表明，高糖環境下可誘導巨噬細胞激活并向M1型分化，參與持續炎癥反應和組織損傷。本實驗應用高糖刺激BMDM，與LG組比較，HG組M1型巨噬細胞比例顯著上升，同時炎癥因子TNF-α、IL-1β、MCP-1表達上調，與上述研究一致，表明高糖誘導下巨噬細胞的活化、浸潤參與DN的炎癥反應過程，然而巨噬細胞參與DN發生發展分子水平的機制目前仍不明確。

圖8 ELISA法檢測各組BMDM培養基中TNF-α、IL-1β、MCP-1的含量

A：LG組；B：HG組；C：TLR4-/-組；D：TLR4-/-+HG組；與LG組比較：*P<0.05,**P<0.01；與HG組比較：#P<0.05,##P<0.01

Dasuetal[9]發現高糖刺激的人單個核細胞TLR2、TLR4表達升高，TLR4基因敲除后其下游信號蛋白及炎癥因子表達明顯降低。Toll樣受體是一組可表達在免疫提呈細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞)及固有細胞表面的參與固有免疫反應的受體家族。研究[10-11]顯示TLR的信號傳導通路可啟動炎癥級聯反應，導致腎臟的損傷和DN的進展。TLR4通過與內源性或外源性配體結合，啟動MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑，引起NF-κB信號通路的激活，最終釋放促炎因子、趨化因子，導致炎癥反應參與DN的發生[12]。Linetal[13]發現TLR4信號通路可促進腎小管間質炎癥反應，Mudaliaretal[14]也在高糖培養的內皮細胞中證實TLR4對炎癥的調節作用，而關于TLR4是否作用于巨噬細胞引起炎癥反應，從而參與DN的進程尚無報道。Orretal[15]發現TLR4的缺乏可促進脂肪巨噬細胞的選擇性激活，且TLR4依賴的巨噬細胞激活可導致視網膜損傷[16]，因而實驗假設TLR4缺乏可抑制巨噬細胞向M1型分化，通過抑制巨噬細胞浸潤及其下游信號通路及產物的激活，減輕炎癥狀態。本實驗顯示高糖可促進TLR4、其下游信號通路MyD88、p-IRAK-1、Trif、p-IRF3、IRF3、NF-κBp-p65、NF-κBp65以及炎癥因子IL-1β、MCP-1、TNF-α表達均顯著增加，而敲除TLR4基因抑制巨噬細胞胞內NF-κB信號通路的激活從而緩解炎癥反應。同時在TLR4和iNOS雙標的激光共聚焦結果中敲除TLR4可同時使iNOS的熒光強度減弱，進一步證實TLR4可通過調節其下游MyD88依賴途徑和非MyD88依賴途徑抑制巨噬細胞活化，引發炎癥反應。

綜上所述，本實驗初步驗證了高糖可誘導BMDM向M1型極化，TLR4參與巨噬細胞極化過程并促進炎癥因子在高糖環境下的合成及釋放；因此敲除TLR4基因可通過抑制巨噬細胞活化，減少炎癥因子的產生，延緩DN的持續進程，為DN的預防和治療提供新的研究方向。

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Role of Toll like receptor 4( TLR 4) signaling pathway in bone marrow derived macrophages activation induced by high glucose

ZhangTingmin,ShaoYunxia,XuXingxin,etal

(Dept of Nephropathy, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)

Objective To investigate the mechanism of high glucose and Toll-like receptor 4(TLR4) signaling pathway in macrophages for promoting the secretion of inflammatory cytokines through observing the effect of high glucose on the expression of TLR4 and its downstream signaling pathway in bone marrow derived macrophages(BMDM).Methods The BMDM were separated from C57BL/6J and B10ScNNju(TLR4 knockout mice),and the purity of which was tested by flow cytometry. Different concentrations of high glucose and mannitol were selected to stimulate BMDM at different time points in order to optimize experimental condition. The BMDM were divided into normal control group(LG), high glucose group(HG), TLR4 knockout group(TLR4-/-) and high glucose stimulated TLR4 knockout BMDM group(TLR4-/-+HG). The M1 phenotype of macrophages was detected by flow cytometry and the co-expression of TLR4 and macrophage activation marker inducible nitric oxide synthase(iNOS) was observed by immunofluorescence. TNF-α, MCP-1 and IL-1β were assessed by RT-PCR and ELISA, together with the mRNA level of iNOS. Western blot was performed to analyze the protein levels of TLR4, MyD88, Trif, p-IRAK-1, p-IRF3, IRF3, NF-κB p65, NF-κB p-p65, iNOS.Results Compared with the LG group, high glucose could increase the percentage of M1 macrophages and the mRNA level of TNF-α, MCP-1, IL-1β and iNOS. In addition, the expression of TLR4, MyD88, Trif, p-IRAK-1, p-IRF3, IRF3, NF-κB p65, NF-κB p-p65, iNOS protein enhanced either. TLR4 knockout could eliminate the effect of macrophage activation induced by high glucose.Conclusion The study suggests that high glucose can promote BMDM to M1 phenotype polarization and TLR4 knockout can inhibit the M1 activation and the production of inflammatory cytokines induced by high glucose.

BMDM;TLR4; high glucose; inflammation

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.002.html

2016-07-14接收

國家自然科學基金(編號：81374034)

安徽醫科大學第一附屬醫院腎臟內科，合肥 230022

張婷敏，女，碩士研究生；

吳永貴，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wuyonggui@medmail.com.cn

R587.24

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.002