徐州貓源弓形蟲株基因型及其毒力研究

朱長東，程維晟，羅慶禮，沈繼龍

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徐州貓源弓形蟲株基因型及其毒力研究

朱長東1,2，程維晟1，羅慶禮1，沈繼龍1

目的 了解貓源弓形蟲株基因型和毒力，為研究其致病機制奠定基礎(chǔ)。方法 自江蘇徐州誘捕采集40只流浪家貓，昆明小鼠腹腔接種分離弓形蟲；采用PCR-RFLP法對10個基因分型位點(SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶水解后觀察分析電泳圖譜；將分離的蟲株分別感染SPF級BALB/c小鼠和昆明鼠，觀察其存活時間和存活率，分析毒力強弱。選取弓形蟲的毒力相關(guān)效應(yīng)分子ROP16和GRA15，PCR擴增出基因序列，比較其多態(tài)性。結(jié)果 共獲得6株貓源弓形蟲蟲株，基因分型結(jié)果顯示，兩株為Chinese1型(即ToxoDB#9型)，4株為ToxoDB#205型；此6株弓形蟲蟲株對BALB/c小鼠和昆明鼠均有較強的毒性，兩種小鼠分別在感染后5～7d和9～12d均100%死亡。毒力相關(guān)基因GRA15和ROP16的分析顯示，Chinese1型蟲株為GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ型，ToxoDB#205型蟲株為GRA15Ⅱ和ROP16Ⅱ型。結(jié)論 徐州地區(qū)貓源弓形蟲蟲株具有有限遺傳多態(tài)性，且均為強毒的蟲株。ToxoDB#205型蟲株的主要毒力效應(yīng)分子ROP16Ⅱ不同于Chinese1型蟲株，這一毒力相關(guān)基因的多態(tài)性與其毒力的關(guān)系尚待深入研究。

弓形蟲；基因型；毒力；GRA15；ROP16

剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性有核細胞內(nèi)寄生的機會致病性原蟲，全球廣泛傳播，可以感染幾乎所有溫血動物，嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。世界各地人和動物體內(nèi)分離的弓形蟲株基因型具有豐富的遺傳多態(tài)性和地域差異，且在不同地域具有不同的優(yōu)勢基因型[1]。近年來的研究[2]表明，流行于我國不同地區(qū)的動物源性弓形蟲株具有有限的遺傳多態(tài)性，且優(yōu)勢基因型為Chinese1型。弓形蟲侵入宿主細胞分泌的多態(tài)性效應(yīng)分子主要包括棒狀體蛋白ROPs家族如ROP16和ROP18等，以及致密顆粒蛋白GRA家族如GRA15、GRA5和GRA3等。其中研究較多的有ROP16和GRA15。該研究采用PCR-RFLP法對徐州貓源弓形蟲株進行基因分型，分析該地區(qū)弓形蟲株基因型和毒力及其毒力相關(guān)分子ROP16和GRA15的多態(tài)性，為深入探討其基因型相關(guān)的毒力效應(yīng)分子多態(tài)性與蟲株致病性的關(guān)系，以及完善我國弓形蟲株的遺傳資源庫，提供重要理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和參考蟲株 成年流浪貓40只，采自江蘇徐州，雌雄不限，經(jīng)麻醉后無痛處死，取全部腦組織進行弓形蟲蟲株分離。4～6 周齡，雌性SPF級BALB/c小鼠60只，昆明鼠180只，均購自安徽省實驗動物中心，室溫下標準飼養(yǎng)。3種參考蟲株DNA為typeⅠ型(GT1)、typeⅡ型(PTG)和typeⅢ型(CTG)，由美國田納西大學(xué)微生物教研室蘇春雷教授惠贈。

1.2 主要試劑和儀器DNA提取試劑盒購自原平皓(天津)生物技術(shù)有限公司；PCR預(yù)混液購自生工生物工程(上海)有限公司；瓊脂糖購自西班牙GENE公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自美國Ferments公司；PCR純化試劑盒購自Axygen公司；基因分型引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；溫度梯度基因擴增儀購自德國MIONETRA公司；電泳儀和電泳槽購自美國BIO-RAD公司；凝膠成像系統(tǒng)購自江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.3 貓源弓形蟲的分離 按照參考文獻[3]方法，無菌取貓腦組織50g，加入125ml無菌生理鹽水，組織勻漿器攪碎制備形成勻漿液；按照1 ∶1的比例，加入37 ℃預(yù)熱的鹽酸胃蛋白酶消化液，置恒溫搖床，37 ℃、150r/min，消化1h。以1 200r/min將濾液離心10min，棄上清液，加入約20ml的PBS(PH7.2)，1 200r/min離心10min，棄上清液；氨芐西林和鏈霉素滅菌生理鹽水稀釋，制成1 ∶10 混懸液(氨芐西林1 000U/ml、鏈霉素100μg/ml)。將上述組織懸液腹腔接種昆明小鼠3只，每只小鼠接種1ml。每天觀察，如小鼠有豎毛、弓背、厭食等明顯表現(xiàn)時，收集腹腔灌洗液涂片，鏡檢。如果接種小鼠存活，待40d后，取腦組織壓片鏡檢。

1.4 弓形蟲DNA的提取 分別取弓形蟲感染小鼠腹水，PBS洗滌3次，離心收集速殖子后，用DNA提取試劑盒提取弓形蟲基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 弓形蟲株RFLP-PCR基因分型 參照文獻[4]中的10個分型標志物基因特異性引物SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico，以本次分離的蟲株及參考蟲株的基因組DNA為模版，擴增上述10個基因片段。反應(yīng)體系如下：弓形蟲DNA模板1.5μl，上下游引物各1μl，PCRPremixTaq25μl，總體積為50μl。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性40s，60 ℃退火40s，72 ℃延伸60s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10min。PCR結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠觀察反應(yīng)結(jié)果。純化PCR產(chǎn)物，并用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶酶切，酶切后產(chǎn)物采用2.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察并記錄結(jié)果。

1.6 蟲株的毒力檢測 分離的弓形蟲株感染昆明小鼠，出現(xiàn)明顯癥狀后收集腹水，按照本實驗室的常規(guī)方法[5]，PBS洗滌3次后經(jīng)梯度離心法純化速殖子，純化后速殖子經(jīng)PBS稀釋至2ml置顯微鏡下計數(shù)，按1×103個/只分別腹腔感染SPF級BALB/c小鼠和昆明鼠，每組各10只。逐日觀察小鼠狀態(tài)并計算死亡率和存活時間；若實驗小鼠長期存活，則至感染后45d，麻醉頸椎脫臼處死各組存活小鼠，腦組織壓片觀察包囊是否形成。累積死亡率(%)=死亡小鼠個數(shù)/感染小鼠個數(shù)×100%。

1.7 毒力相關(guān)基因分析 依據(jù)基因庫中弓形蟲蟲株的毒力相關(guān)基因ROP16和GRA15的全長，設(shè)計PCR擴增引物，對分離的蟲株進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后，送生工生物工程(上海)有限公司進行測序，根據(jù)測序結(jié)果，比較ROP16和GRA15的核苷酸序列差異。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行分析。根據(jù)小鼠感染不同弓形蟲株的存活時間、死亡率，采用χ2檢驗對小鼠感染各蟲株反應(yīng)有無差異，不同蟲株兩兩檢驗。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲基因分型 上述40只流浪貓共分離出6株弓形蟲株。采用通用的10個基因分型遺傳位點，對此6株貓源弓形蟲株(按貓的編號分別為TgCtxz9、34、37、38、39、40)進行基因分型，共發(fā)現(xiàn)Chinese1型(即ToxoDB#9型)2株，ToxoDB#205型4株。見圖1、表1。在SAG3位點，蟲株TgCtxz34和TgCtxz38與Ⅲ型相同，而蟲株TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40與I型相同；在c29-2位點，蟲株TgCtxz34和TgCtxz38與Ⅲ型相同，而TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40與II型相同。這一譜型顯示蟲株TgCtxz34和TgCtxz38為Chinese1型，而蟲株TgCtxz9、TgCtxz37、TgCtxz39和TgCtxz40為ToxoDB#205型。

圖1 2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定SAG3和c29-2基因PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

M：50bpDNALadderMarker；A：SAG3；B：c29-2；Ⅰ：GT1；Ⅱ：PTG；Ⅲ：CTG；1：TgCtxz9；2：TgCtxz34；3：TgCtxz37；4：TgCtxz38；5：TgCtxz39；6：TgCtxz40

2.2 蟲株毒力 每個分離蟲株取1×103速殖子經(jīng)腹腔接種BALB/c小鼠后，第5天開始出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀，至第7 天完全死亡。昆明小鼠腹腔接種同樣數(shù)量速殖子后，存活時間略長于BALB/c小鼠，但在12d之內(nèi)亦全部死亡(表2)。實驗中未發(fā)現(xiàn)小鼠能長期存活的成囊蟲株。各蟲株之間的毒力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在兩種品系小鼠之間，感染同一蟲株的昆明小鼠存活時間明顯長于BALB/c小鼠(P<0.01)，表現(xiàn)出同一蟲株對不同品系的小鼠有著不同的毒力。

表1 中國徐州6株貓源性弓形蟲株基因分型

表2 小鼠分別感染6株弓形蟲株后存活時間比較

2.3 毒力相關(guān)基因 通過PCR擴增6株弓形蟲的毒力相關(guān)分子GRA15和ROP16，并測序。結(jié)果顯示，Chinese1型2個蟲株攜帶GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ；而ToxoDB#205型4個蟲株攜帶GRA15Ⅱ和ROP16Ⅱ，表現(xiàn)出明顯的差異性(表3)。

表3 毒力相關(guān)基因GRA15和ROP16多態(tài)性分析

3 討論

近年來，隨著對于弓形蟲廣泛深入的研究，其基因型也得到充分的認識，研究[1]表明，世界各地的弓形蟲株基因型具有豐富的遺傳多態(tài)性，可分成A～F6個進化枝(Clade)。目前已知全球人獸分離的弓形蟲基因型具有地域的顯著變異。北美和歐洲主要分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3個基因型[6]。南美洲的弓形蟲基因型十分復(fù)雜，大致包括BrⅠ～Ⅳ等4個基因型[7]。我國的弓形蟲基因分型及其與致病的關(guān)系研究較晚。本實驗室以及國內(nèi)其他學(xué)者的研究[5,8-10]顯示，相對于世界各地弓形蟲蟲株的多態(tài)性，流行于中國的弓形蟲蟲株具有有限的遺傳多態(tài)性，且以Chinese1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢基因型，約占總分離株的70%以上。此外，尚有少數(shù)其他的基因型，如：ToxoDB#1(TypeⅡ型)、ToxoDB#3、ToxoDB#10(TypeⅠ型)、ToxoDB#205和ToxoDB#213等。本次的實驗結(jié)果顯示，徐州流行的貓源弓形蟲蟲株主要有兩種基因型即Chinese1型和ToxoDB#205型，與既往研究[2]結(jié)果相符。

研究[11]顯示，弓形蟲不同的基因型對宿主細胞的入侵過程具有顯著差異。弓形蟲入侵宿主細胞其實是一系列蟲體分泌蛋白協(xié)助肌動蛋白動作入侵的過程，分泌的蛋白包括ROPs、GRAs、MICs、RONs等多種效應(yīng)分子，主要由致密顆粒(densegranule)、棒狀體(rhoptry)與微線體(microneme)這3類分泌器分泌，這些效應(yīng)分子在蟲體識別、黏附、入侵、PVM形成、增殖、出胞以及誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答，甚至感染結(jié)局等方面起到關(guān)鍵的作用，且ROPs和GRAs具有多態(tài)性[12-13]。

GRAs家族蛋白成員GRA15與ROPs家族的蛋白成員ROP16具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶樣活性，并同時具有基因型或蟲株的多態(tài)性[11]。其中I型與III型蟲株的ROP16Ⅰ/Ⅲ高度同源，可以限制Th1型免疫反應(yīng)，抑制IFN-γ的表達和IRGs的募集，導(dǎo)致蟲體過度增殖甚至宿主死亡；而Ⅱ型蟲株的ROP16Ⅱ則無此作用。Ⅱ型蟲株的GRA15Ⅱ基因較Ⅰ、Ⅲ型C末端具有完整的AA312～550的片段，可以促進宿主細胞IL-12分泌，可以誘導(dǎo)巨噬細胞向經(jīng)典途徑激活的巨噬細胞(classicactivatedmacrophages，M1) 極化，抑制精氨酸合成，高表達誘導(dǎo)性NO合酶(iNOS)，ROS與NO釋放增加，殺傷蟲體，并且活化NK、Th1和Th17細胞，擴大炎癥反應(yīng)，使宿主獲得強力免疫力，而Ⅰ、Ⅲ型蟲株的GRA15Ⅰ/Ⅲ則無此作用。

本次的研究顯示，流行于徐州的弓形蟲Chinese1型蟲株攜帶有多態(tài)性的GRA15Ⅱ基因和ROP16Ⅰ/Ⅲ基因，和既往的研究[2]結(jié)果一致。提示其毒力和致病性既不同于歐美的Ⅰ型蟲株，也不同于Ⅱ型蟲株，其毒力相關(guān)分子的功能及作用機制值得深入研究。而ToxoDB#205蟲株不同于Chinese1，前者攜帶有GRA15Ⅱ基因和ROP16Ⅱ基因，與Ⅱ型蟲株一致。本實驗中感染小鼠均在急性期死亡，兩個基因型蟲株感染同品系小鼠后死亡時間未見顯著差異，提示均為強毒蟲株。因此，我國流行的弓形蟲不同基因型的蟲株毒力上存在其他毒力相關(guān)分子。

本研究對弓形蟲蟲株的采集和基因分型，豐富了我國現(xiàn)有的弓形蟲蟲株基因型的數(shù)據(jù)，提示不僅有我國優(yōu)勢基因型Chinese1型流行，而且ToxoDB#205也有廣泛的分布，同時也為進一步探討我國弓形蟲蟲株基因資源研究和弓形蟲基因型相關(guān)的致病機制的研究提供了理論依據(jù)和實驗依據(jù)。GRA15Ⅱ和ROP16Ⅰ/Ⅲ誘導(dǎo)宿主的差異性免疫應(yīng)答特點及機制有待進一步研究。

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Genotypes and virulence of Toxoplasma gondii isolates from cats in Xuzhou

ZhuChangdong1, 2,ChengWeisheng1,LuoQingli1,etal

(1Dept of Microbiology and Parasitology of Anhui Medical University, Anhui Provincial Laboratory of Pathogen Biology, Anhui Key Laboratory of Zoonoses, Hefei 230032;2Dept of Clinical Laboratory of Lujiang People′s Hospital, Lujiang 231500)

Objective To investigate the genotype and virulence related effectors of theToxoplasmagondiiisolates from cat in Xuzhou.Methods The strains ofT.gondii, which had been isolated from Xuzhou in Eastern China, were genotyped with PCR-RFLP at 10 genetic markers. At the same time, the virulence was analyzedviaobserva-

Toxoplasmagondii; genotyping; virulence; GRA15; ROP16

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.006.html

2016-06-12接收

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號：2010CB530001)；國家自然科學(xué)基金(編號：81471983)

1安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室、安徽病原生物學(xué)省級實驗室、人獸共患病安徽省重點實驗室，合肥 230032

2安徽省廬江縣人民醫(yī)院檢驗科，廬江 231500

朱長東，男，碩士研究生，主管檢驗師；

沈繼龍，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shenjilong53@126.com；

羅慶禮，男，助理研究員，責(zé)任作者，E-mail：luoqingli@ahmu.edu.cn

R382.5

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.006

tion of the survival time and survival rate after techyzoites inoculation, and BALB/c mice and Kunming mice were infected respectively withT.gondii. The coding sequences of virulence related effectors of GRA15 and ROP16 were amplified by PCR, and the polymorphism was compared.Results A total of 6 strains ofT.gondiiwere isolated from cats, and genotyping results showed that 2 strains belonged to type Chinese 1(ToxoDB#9) and 4 strains were found to be ToxoDB#205. All of the six isolates exhibited strong virulence, leading to 100% death after 5～7 days in BALB/c mice and 9～12 days in Kunming mice post-infection. The analysis of virulence related GRA15 and ROP16 genes showed that the Chinese 1 strains possessed the polymorphic GRA15Ⅱand ROP16Ⅰ/Ⅲ, whereas the ToxoDB#205 strains carried GRA15Ⅱand ROP16Ⅱ.Conclusion TheT.gondiiisolates collected from Xuzhou have limited genotypes which share the polymorphic virulence effectors.