兒童感染MRCNS的藥敏分析及SCCmec基因分型研究

熊玉玲，夏小榮，朱玉林，李長春，王亞亭

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兒童感染MRCNS的藥敏分析及SCCmec基因分型研究

熊玉玲，夏小榮，朱玉林，李長春，王亞亭

目的 了解安徽地區兒童感染耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)的耐藥現狀和葡萄球菌盒式染色體(SCCmec)基因型分布及各基因型的耐藥特點。方法 對安徽地區近6年臨床分離的兒童感染凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)進行表型篩選，并利用聚合酶鏈反應(PCR)擴增mecA的方法收集MRCNS菌株。采用標準瓊脂倍比稀釋法測定MRCNS 16種抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)值，同時利用PCR對MRCNS進行SCCmec基因分型。結果 經表型篩選及mecA基因檢測雙重方法共收集MRCNS 186株，包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌及少數其他類型MRCNS，分別為45.7%(85/186)、24.7%(46/186)、18.8%(35/186)及10.8%(20/186)。耐藥分析顯示MRCNS對青霉素、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南耐藥率達100%，紅霉素和阿奇霉素的耐藥率大多在90%以上，對環丙沙星、克林霉素耐藥率為80%左右，對慶大霉素、左氧氟沙星的耐藥率為40%左右，對利福平的耐藥率為20%左右，對氯霉素的耐藥率為10%左右，對替考拉寧、萬古霉素的耐藥率分別為2.2%(4/186)、0.5%(1/186)。186株MRCNS的SCCmec分型共有Ⅰ～Ⅴ 5種型別，以Ⅲ型為主，Ⅳ型檢出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd 3種亞型，并有較多的混合型存在。各基因型對多種抗菌藥物呈不同程度的耐藥。結論 安徽地區臨床分離的兒童MRCNS對多種常用抗菌藥物不敏感，具有多重耐藥性，其中出現萬古霉素表型耐藥菌株，應予警惕。不同類型的MRCNS所攜帶的SCCmec型別不同，SCCmecⅢ型為主要流行菌株。SCCmec基因型與耐藥譜有著密切的關系。

兒童；耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌；耐藥性；聚合酶鏈反應；SCCmec基因型

凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase negativeStaphylococcus, CNS)屬于革蘭陽性球菌的重要一員，因不能產生血漿凝固酶和溶血素等物質一直被認為是皮膚黏膜的正常菌群或者機會致病菌。近年來，隨著分子生物學材料領域的迅速發展，許多侵入性診療技術以及新的高效廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑在兒科臨床中的廣泛應用，由CNS造成的感染日趨嚴重，成為醫院感染的重要病原菌[1-2]。國內外資料[3]顯示CNS是兒科感染最常見的病原菌，尤其是新生兒、早產兒、低出生體重兒敗血癥的常見病原菌，其中耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin resistant coagulase negativeStaphylococcus, MRCNS)占主導地位。兒童MRCNS的檢出率和多重耐藥性呈逐年增高趨勢，已成為兒科感染和臨床治療的重要問題。葡萄球菌盒染色體mec(Staphylococcalchromosomal cassettemec,SCCmec)是攜帶mecA基因的新型移動基因元件，主要由攜帶mecA基因的mec基因復合體、編碼位點特異性重組酶的盒式染色體重組酶基因復合物以及功能未知的可變區域構成，具有自發剔除、重組的特性，是葡萄球菌耐藥性產生、耐藥譜擴大的根本原因[4]。該研究對安徽地區近6年兒童感染MRCNS菌株進行SCCmec基因分型研究，為了解菌株來源、流行趨勢和臨床合理選用抗菌藥物以及制定MRCNS 感染的防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源及鑒定 收集安徽省細菌耐藥監測中心38所醫院近6年住院患兒的各種臨床送檢血液標本無重復分離的MRCNS共186株。全部菌株已由Microscan WalkAway-40全自動微生物分析儀(美國DADE公司)自動鑒定系統初步鑒定，經表型篩選后由聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增甲氧西林耐藥基因mecA而確定為MRCNS。質控菌株ATCC43300、ATCC25923和ATCC29213由安徽省細菌耐藥監控中心保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

1.1.2.1 試劑 dNTP Mixture、Taq Buffer、DL 600 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker、6×Loading Buffer、瓊脂糖、PCR反應引物均購自上海生工生物工程公司；溴化乙錠干粉、溶葡萄球菌素(SIGMA)購自大連寶生物公司；Mueller-Hinton(M-H)培養基、瓊脂粉均購自英國Oxiod 公司。

1.1.2.2 抗菌藥物 用于MIC測定的抗菌藥物：苯唑西林、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、氯霉素、克林霉素、紅霉素、阿奇霉素、青霉素、亞胺培南、美羅培南、環丙沙星、左氧氟沙星、萬古霉素、替考拉寧、利福平共17種，均購自中國藥品生物制品檢定所，均在有效期內使用。

1.1.2.3 儀器 多點接種儀(英國 AQS Manufacturing公司)；電熱恒溫培養箱(上海精宏公司)；32R低溫離心機(德國Hettich公司)；電子天平(上海名橋精密科學儀器公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)；PCR 儀器(德國Biometra公司)；電泳儀加電泳槽(北京六一儀器廠)；超低溫冰箱(日本三洋制冷設備公司)；純水機(美國Labconco公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；一次性玻璃試管、PCR管、EP 管、一次性細菌培養皿(上海生工生物工程技術有限公司)。

1.1.3 PCR引物 參照文獻[5]報道設計PCR引物序列，并在Pubmed上進行BLAST基因序列比對，委托上海生工生物工程技術有限公司合成，見表1。

表1 SCCmec引物序列

1.2 方法

1.2.1 表型篩選MRCNS 參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2013推薦的表型篩選耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus, MRSA)的方法，用標準瓊脂倍比稀釋法進行苯唑西林最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值的測定及結果判讀，若苯唑西林MIC值≥0.5 μg/ml,則初篩該菌株為MRCNS，對初篩的MRCNS再進行mecA基因檢測，兩種檢測方法均為陽性者確定為MRCNS菌株。

1.2.2 DNA模板的提取 將平板上的經16～18 h過夜培養的新鮮MRCNS(經表型篩選后)單個菌落，加入200 μl滅菌去離子水和適量葡萄球菌溶菌素，混勻，100 ℃煮沸10～15 min后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為PCR擴增反應模板，-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR法鑒定MRCNS PCR反應在0.5 ml薄壁管中進行，總反應體積為25 μl：10 mmol/L dNTP 0.5 μl，10 pmol/L上下游引物(表1)各1 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，模板DNA 1 μl，TaqDNA聚合酶0.5 U(5 U/μl)，25 mmol/L MgCl21.5 μl，最后滅菌去離子水補齊至25 μl。擴增條件：95 ℃預變性5 min，然后進入PCR循環：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，72 ℃延伸5 min；每次用標準株ATCC43300作陽性對照。將5 μl PCR擴增產物和1 μl 6×Loading Buffer混勻后，加在1%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙錠和1×TAE)上，電泳電壓為120 V，電流為80 mA、30 min，凝膠成像分析系統攝像，保存結果。對于147 bp處有明亮條帶者判定為MRCNS，陰性菌株重復試驗1次。

1.2.4 MRCNS藥敏試驗 采用標準瓊脂倍比稀釋法對MRCNS進行MIC值的測定和結果判讀。以ATCC29213、ATCC25923為質控標準株，質控標準菌株對各種抗菌藥物藥敏結果均在CLSI2013規定的范圍內。

1.2.5 MRCNS的SCCmec基因分型 對明確為MRCNS的菌株進行SCCmec基因分型，反應體系及反應條件同1.2.3，PCR擴增產物經電泳后，凝膠成像分析系統攝像，分析并保存結果。對陰性菌株重復試驗1次。

1.2.6 擴增產物的測序和分析 PCR產物委托上海生工生物工程技術有限公司進行測序，所得測序結果在Pubmed中進行BLAST基因序列比對。

2 結果

2.1 MRCNS種類分布及檢出率 186株MRCNS經表型篩選及PCR檢測mecA均為陽性，其中包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusepidermidis,MRSE)85株、耐甲氧西林溶血葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcushaemolyticus,MRSH)46株、耐甲氧西林人葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcushominis, MRSHo)35株、耐甲氧西林木糖葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusxylosus, MRSX)6株、耐甲氧西林松鼠葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussciuri, MRSSc)4株、耐甲氧西林模仿葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussimulans, MRSSi)4株、耐甲氧西林華納葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcuswarneri, MRSW)3株、耐甲氧西林腐生葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussaprophyticus, MRSSa)1株、耐甲氧西林耳葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusauricularis, MRAS)1株、耐甲氧西林頭狀葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcuscapitis, MRSCa)1株，MRCNS分類構成比見表2。

2.2 MRCNS耐藥性分析 MRCNS對16種常見抗菌藥物耐藥率見表3。1株攜帶mecA基因的萬古霉素表型耐藥菌株，其對除利福平、左氧氟沙星的多種抗菌藥物耐藥。

2.3 MRCNS的SCCmec基因分型 186株MRCNS的mecA基因均為陽性，共檢出Ⅰ～Ⅴ 5種型別，Ⅳ型檢出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd 3種亞型，電泳結果見圖1。不同類型的MRCNS所攜帶的SCCmec型別檢出結果見表4。

表2 MRCNS分類構成比

圖1 mecA與SCCmec基因擴增產物電泳結果

M：Marker；1：ATCC29213；2：ATCC43300；3～4：mecA；5～6：SCCmecⅠ；7～8：SCCmecⅡ；9～10：SCCmecⅢ；11～12：SCCmecⅣa；13～14：SCCmecⅣc；15～16：SCCmecⅣd；17～18：SCCmecV

2.4 MRCNS不同SCCmec型別的耐藥率 所有型別對青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、美羅培南、亞胺培南、阿奇霉素、紅霉素、克林霉素及環丙沙星的耐藥率均很高；除個別III型和混合型外，所有型別對替考拉寧和萬古霉素敏感；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、混合型及未分型對利福平、左氧氟沙星、慶大霉素均有不同程度的耐藥，且耐藥率高于Ⅳ、Ⅴ型；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ未發現氯霉素耐藥菌株，見表5。

表3 148株兒童MRCNS對16種抗生素的耐藥率[n(%)]

表4 SCCmec基因分布結果[n(%)]

表5 MRCNS不同SCCmec基因型的耐藥率[n(%)]

3 討論

近年來，我國兒童MRCNS的多數資料集中在75%左右[2，6]。兒童MRCNS的檢出率和多重耐藥性呈逐年增高趨勢，因其毒力低、侵襲力弱、患兒感染后癥狀不典型等特點，給臨床診斷和治療帶來一定困難。MRCNS不僅對于所有耐酶青霉素如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林耐藥，而且對包括各類廣譜青霉素和頭孢類(如頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢美唑、頭孢哌酮等)、氨基糖苷類(如鏈霉素、慶大霉素等)、大環內酯類、喹諾酮類、碳青霉烯類(如亞胺培南、美羅培南等)、利福平均具有不同程度的耐藥[7]。MRCNS的耐藥性來源，一方面是固有耐藥性，這是由染色體介導的；另一方面是獲得耐藥性，這與質粒產生的β-內酰胺酶有關，細菌之間傳遞耐藥基因，很多靠質粒來完成，即在葡萄球菌菌屬之間通過質粒傳遞耐藥基因，使耐藥基因擴大而產生耐藥；此外，生物膜的形成和主動外排系統與MRCNS的耐藥性有密切關系[8-9]。本研究分離的兒童MRCNS菌株同樣對多種抗菌藥物耐藥。如MRCNS對青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、阿奇霉素、紅霉素、克林霉素、美羅培南、亞胺培南的耐藥性均很高，達90%～100%，一定程度上反應了β-內酰胺類抗菌藥物、三代頭孢類抗菌藥物、大環內酯類抗菌藥物、林可霉素類抗菌藥物及碳青霉烯類抗菌藥物在臨床的廣泛應用；相對而言，對左氧氟沙星、慶大霉素、氯霉素及利福平的耐藥性較低，可能與其對兒童生長發育有較多的不良反應有關；例如，左氧氟沙星易引起鈣流失，長期使用會導致兒童軟骨病發生；慶大霉素會影響兒童腦神經發育，導致聽力下降；長期大劑量地使用氯霉素會對兒童骨髓造血系統產生抑制；利福平對兒童的肝功能有嚴重損害。也可能與單獨使用這些抗菌藥物易產生耐藥等因素有關，所以這些藥較少應用于兒科臨床治療。糖肽類抗菌藥物如替考拉寧、萬古霉素作為MRCNS治療的最后防線，本研究顯示其表型耐藥菌株，考慮可能是因兒童特殊的生理特點及對多種抗菌藥物的不良反應，限制很多藥物的使用，而萬古霉素有效的臨床應用先例，使其在兒科領域廣泛應用，給兒童MRCNS的治療帶來潛在的威脅。因此，為控制兒童MRCNS多重耐藥率升高，對考慮敗血癥的患兒，臨床醫師宜早期進行血培養及加大抗菌藥物使用前微生物標本的送檢率，并依據藥敏結果合理選用有效抗菌藥物，以減少耐藥菌株的產生和提高療效。

SCCmec是一種攜帶mecA基因的新型移動基因元件。在不同的MRCNS菌株中，因外源性耐藥基因的轉移、嫁接，以及不同SCCmec之間耐藥基因的交換，造成SCCmec染色體基因序列突變、插入或缺失，使得mec基因簇、重組酶基因簇及可變區域出現結構上的差異，這種結構上差異性是SCCmec分型的分子生物學基礎。目前國外采用分子生物學技術將SCCmec基因分成Ⅰ～Ⅷ 8種類型，每一型又包含不同亞型，如Ⅳ型包括Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd 4個亞型[10-11]。SCCmec可自主從染色體上切除，以適當方式重組于受體葡萄球菌染色體上，使其獲得耐藥性；SCCmec使耐藥基因在菌株間水平傳播，從而導致耐藥譜擴大和新的SCCmec型別的產生。SCCmec的基因型與MRCNS流行背景有關，不同地區和遺傳背景的克隆株攜帶SCCmec可能不同[12-14]。本研究的186株MRCNS可擴增Ⅰ～Ⅴ 5種SCCmec基因型，Ⅳ型可擴增出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd。安徽地區兒童MRCNS的SCCmec基因分型以Ⅲ型為主要流行株，占50.5%(94/186)，同國內其他地區報道[15-16]結果一致；其次為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ彼此之間或與其他各型混合，占19.4%(36/186)；剩余的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd及Ⅴ各型所占比例較少，分別為4.3%(8/186)、3.8%(7/186)、3.8%(7/186)、0.5%(1/186)、1.1%(2/186)及2.2%(4/186)。但有14.5%(27/186)未能分型，可能由于SCCmec移動模塊的變異率非常高，自身不斷地發生突變、插入或缺失，造成了擴增引物區序列的變化，從而PCR檢測的方法失敗；也可能有其他耐藥機制或者新的耐藥基因的出現，尚不在本研究范圍。

SCCmec基因型與耐藥譜有著密切的關系，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型由于基因序列較長，內含耐藥基因的質粒或轉座子，呈多重耐藥性，常常表現對β-內酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、大環內酯類及氟喹諾酮類等抗菌藥物耐藥；而Ⅳ、Ⅴ型除含mecA基因外，很少含有其他的耐藥基因，對非β-內酰胺類抗菌藥物耐藥率大多低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，這種耐藥程度上的差異可以為臨床治療MRCNS提供依據。

綜上所述，安徽地區近6年臨床分離的兒童MRCNS具有多重耐藥的特征，并存在萬古霉素表型耐藥菌株，兒科醫師應提高感染患兒抗菌藥物使用前微生物標本的送檢率，盡可能根據藥敏結果，合理選用有效抗菌藥物。SCCmecⅢ型為主要流行株。因此，SCCmec基因型別的確定，對制定兒童MRCNS感染預防和控制措施有重要意義。

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On antibiotic resistance andSCCmecmolecular epidemiology

of methicillin resistant coagulase negativeStaphylococciin Children

Xiong Yuling, Xia Xiaorong, Zhu Yulin,et al

(DeptofPaediatrics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To learn the drug resistance of methicillin resistant coagulase negativeStaphylococcus(MRCNS) and to investigate the distribution and antimicrobial resisitance of different MRCNSSCCmecgenotyping from children in Anhui. Methods Resistance phenotype screening and Polymerase Chain Reaction(PCR)mecAgene detection were conducted in clinical strains of coagulase negativeStaphylococcus, in order to collect MRCNS in recent six years from children in Anhui. Minimal inhibitory concentrations of 16 antibiotics were determined by agar dilution method, thenSCCmectypes were determined by PCR methods. Results A total of 186 MRCNS were detected by resistance phenotype screening and PCRmecAgene detection methods.There were 45.7%(85/186) methicillin resistantStaphylococcusepidermidis, 24.7%(46/186) methicillin resistantStaphylococcushaemolyticus, 18.8%(35/186) methicillin resistantStaphylococcushominis, 10.7%(20/186) other types of MRCNS. Drug resistance analysis showed the resisitance rates to penicillin, cefoperazone, cefotaxime, ceftriaxone, imipenem, and meropenem were 100%, to erythromycin and azithromycin were about 90%, to ciprofloxacin and clindamycin were about 80%, to gentamicin and levofloxacin were about 40%, to rifampincin was about 20%, to chloramphenicol, teicoplanin and vancomycin were 10%, 2.2% and 0.5%. Ⅰ to ⅤSCCmecgenotypes were detected in 186 MRCNS, the major type wasSCCmectype Ⅲ. Three subtypes of Ⅳ genotype were identified, including Ⅳa, Ⅳc and Ⅳd, the second type was hybrid type. Each genotype showed varying degrees of resistance to several antibiotics. Conclusion Clinical strains of children infected MRCNS isolated from Anhui have multiple resistances to commonly used antibiotics. It should be on alert that vancomycin phenotypic drug resistant strain appears. Different types of MRCNS carry different types ofSCCmec,SCCmecⅢ genotype is the major epidemic isolates.SCCmecgenotype and drug resistance spectrum have a close relationship.

children; methicillin resistant coagulase negativeStaphylococci; drug resistance; polymerase chain reaction;Staphylococcalcassette chromosomemec

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.008.html

2016-05-30接收

安徽省自然科學基金(編號：1408085QH157)

安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022

熊玉玲，女，碩士研究生；

王亞亭，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail:wangyating1348@126.com

R 446.5

A

1000-1492(2016)10-1430-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.008