乳源免疫調節肽提高DDP對卵巢癌細胞的影響

周 娟，劉 琛，顧 芳，趙夢靜，楊 雪，王 晶，秦宜德

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乳源免疫調節肽提高DDP對卵巢癌細胞的影響

周 娟1，劉 琛1，顧 芳1，趙夢靜1，楊 雪1，王 晶2，秦宜德1

目的 觀察體外實驗中乳源免疫調節肽(PGPIPN)與抗癌藥物順鉑(DDP)聯合用藥對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響。方法MTS檢測DDP聯合PGPIPN對原代卵巢癌細胞增殖抑制情況，流式細胞術檢測DDP聯合PGPIPN對原代卵巢癌細胞凋亡率和周期的影響，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。結果MTS實驗表明PGPIPN聯合DDP處理組對卵巢癌細胞抑制率顯著高于單獨用DDP組,差異有統計學意義(P<0.05)，且呈劑量和時間依賴性。流式細胞術顯示PGPIPN可以協同DDP促進人原代卵巢癌細胞的凋亡，并使得腫瘤細胞停滯于G0/G1期。細胞劃痕實驗顯示聯合用藥明顯抑制細胞的運動能力，與單獨用藥差異有統計學意義(P<0.05)。結論PGPIPN可以提高DDP對原代卵巢癌細胞的作用。

人原代卵巢癌細胞；聯合用藥；免疫調節肽；順鉑

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其發病率位于女性生殖道惡性腫瘤的前列[1-2]。現有的治療主要是手術和化療兩種方式，但化療很容易出現耐藥性，進而治療效果逐漸降低，導致患者死亡率增高。如何增強卵巢癌對化療藥物的敏感性逐漸成為新的研究方向。乳源免疫調節肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)來源于牛乳β-酪蛋白的 63～68氨基酸殘基上的六肽，是一種典型的免疫調節肽。細胞實驗研究[3-4]顯示PGPIPN可以抑制卵巢癌細胞SKVO3的侵襲和轉移，并促進其凋亡。動物實驗[5-6]顯示PGPIPN具有提高機體免疫力、促進淋巴細胞轉化、抗氧化等作用。該研究基于前期研究的基礎上，通過PGPIPN與DDP聯合用藥對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響來觀察PGPIPN是否能改善卵巢癌對DDP的耐藥性，為臨床提高化療敏感性提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 人卵巢癌組織 取自安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科手術室。

1.2 材料 純度為99.6%的PGPIPN由上海生工公司合成；McCoy′s5AMedium培養基(美國Sigma公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；順鉑(江蘇諾欣藥業公司)；CellTiter96AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒(MTS) (普洛麥格北京生物技術有限公司)；PI單染周期檢測試劑盒(江蘇碧云天公司)；AnnexinV/PI雙染凋亡試劑盒(上海貝博公司)。

1.3 方法

1.3.1 原代細胞培養 卵巢癌手術結束后盡快用預冷的含10%血清DMEM培養基運送至細胞房，用預冷無菌PBS緩慢沖洗癌組織塊上的血細胞。無菌操作下將組織塊用無菌眼科剪剪成1mm×1mm×1mm左右，無菌操作下轉移至無菌50ml試管中，加入1.5%的胰蛋白酶，消化40～50min后，800r/min離心5min，棄上清液。將消化結束后的組織塊用含20%胎牛血清的DMEM培養基吹打混勻后種于6孔板中放于37 ℃、5%CO2溫箱培養。48h后將未貼壁的組織用PBS沖洗去除，貼壁的細胞繼續培養至匯合率為70%～80%，傳代后進行下一步實驗。

1.3.2 免疫熒光法鑒定細胞 將滅菌后的蓋玻片放在6孔板孔底部，將原代細胞種于6孔板中制成細胞爬片，放于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24h。棄去培養基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞20min后，PBS洗3次，加入0.7%的Triton-100通透10min后，PBS洗3遍，10%羊血清封閉30min，PBS洗3遍后，加入一抗CK7(1 ∶200)，4 ℃過夜，PBS洗3遍，加入熒光二抗(1 ∶100) ，37 ℃避光孵育2h，避光下PBS洗3遍，避光下DAPI染10min，PBS洗3遍后將細胞爬片進行封片，立即在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3MTS檢測聯合用藥對人原代卵巢癌細胞增值的影響 原代細胞消化離心后制備成細胞懸液按照每孔1 500個細胞接種于96孔板中，培育過夜。分為5組加藥：正常對照組、10μg/mlDDP、10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN，每組復孔5個，分別培養24、48、72h后，每孔加入20μlMTS放于37 ℃溫箱繼續孵育4h。用酶標儀檢測各孔的490nm的吸光度(opticaldensity，OD)值(OD490nm)，以正常對照組計算用藥組的生長抑制率。計算公式為：抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD正常對照組)×100%。

1.3.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 原代細胞消化離心計數后每孔1×106接種于6孔板中，培養至細胞完全匯合后，用200μl的移液器槍頭在6孔板每孔中央的縱軸和橫軸方向劃一個十字線。用PBS洗2遍后分為5組加藥：正常對照組(3%血清培養基)、8μg/mlDDP、8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN、8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN(藥物均用3%血清培養基稀釋)。在0、12、24、36h分別于倒置顯微鏡下觀察并拍照。用QuantityOne軟件對細胞的遷移距離進行測量，分別測3條線的寬度，取其平均值，計算遷移距離，其計算公式為：遷移距離(mm)=0h起始距離-各時間段的距離。

1.3.5AnnexinV/PI雙染檢測細胞的凋亡 原代細胞消化離心計數后每孔1×106接種于6孔板中培養過夜，分為5組加藥，分組同1.3.3。培養48h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞后用預冷的PBS洗滌2次。每管加入300μlBindingBuffer和4μlAnnexinV-FITC懸浮細胞，4 ℃避光孵育15min后加入 7.5μlPI，5min后在流式細胞儀上進行檢測，結果用FlowJo7.6.1軟件進行分析。

1.3.6PI單染檢測細胞的周期原代細胞消化 離心計數后每孔1×106接種于6孔板中培養過夜，分為5組加藥，分組同1.3.3，用藥48h后收集細胞。冷PBS洗滌2次后用70%酒精4 ℃固定過夜。固定結束后用冷PBS洗滌2次，每管加入16μlPI染色液、6μlRNaseA、300μl染色緩沖液，充分混勻后37 ℃避光孵育30min后在流式細胞儀上進行檢測，結果用MFLT.32軟件進行分析。

2 結果

2.1 細胞鑒定 組織消化法培養原代卵巢癌細胞48h，去除未貼壁的組織后，在倒置顯微鏡下的形態見圖1A。將原代細胞制備成細胞爬片后，用特異性抗體CK7、有FITC的二抗鑒定細胞，細胞純度通過以DAPI染色所得細胞核為準來計算。在熒光顯微鏡下可見：由于卵巢癌細胞表達CK7可見綠色熒光，細胞核呈藍色熒光,見圖1。原代組織培養所得的細胞為卵巢癌細胞，且純度較高(96.8%)。

圖1 原代細胞鑒定 ×100

A：組織消化法培養原代卵巢癌細胞(箭頭所指為組織塊)；B：DAPI；C：FITC；D：B和C圖疊加

2.2 聯合用藥對人原代卵巢癌細胞的增殖的影響 實驗通過不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細胞，結果顯示細胞的生長抑制率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高(F=203.84)，且隨著時間的延長而增高(F=4 848.20)。以不加藥的正常對照組計算生長抑制率并繪制曲線圖。聯合用藥組與DDP單獨用藥組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 MTS檢測聯合用藥對人原代卵巢癌細胞的增殖影響

A：10μg/mlDDP；B：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；C：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；與10μg/mlDDP組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖3 不同濃度PGPIPN聯合的DDP對人原代卵巢癌細胞遷移的影響 ×100

A：正常對照組；B：8μg/mlDDP；C：8μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：8μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：8μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；1：0h；2：12h；3：24h；4：36h

圖4 人原代卵巢癌細胞遷移距離與8 μg/ml DDP組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.3 聯合用藥對細胞遷移的影響 不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細胞，結果顯示細胞的遷移距離隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸減低(12h：F=13.35；24h：F=11.64；36h：F=15.30)。顯微鏡下結果見圖3。以0h為起始距離計算遷移距離，與8μg/mlDDP組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。結果表明，PGPIPN可以促進DDP抑制人原代卵巢癌細胞遷移。

2.4 聯合用藥對細胞凋亡的影響 實驗通過不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細胞，結果顯示細胞的凋亡率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高(F=111.20)，表明PGPIPN有協同DDP的作用，可以促進原代卵巢癌細胞的凋亡，見圖5。

2.5 聯合用藥對細胞周期的影響 流式細胞術檢測顯示，與單獨DDP組比較，聯合用藥組隨著PGPIPN(10-6、10-4、10-2mg/ml)的濃度增加，S期逐漸下降，結果如下：9.21%、5.56%、0，而G1和G2期逐漸增高。實驗結果表明PGPIPN與DDP聯合使用主要是作用在G0/G1期。使得細胞停滯于G0/G1期，進而誘導細胞的凋亡并抑制增殖，見圖6。

3 討論

現有主要治療卵巢癌的化療藥物有順鉑、紫杉醇等，但由于卵巢癌耐藥性的出現，使得順鉑的治療效果降低，卵巢癌的死亡率也逐年遞增。因此臨床上急需一種新藥物來降低卵巢癌對順鉑的耐藥性，減少藥物用量，降低患者死亡率。

前期研究[6-7]表明，PGPIPN能顯著促進腹腔巨噬細胞吞噬活性，刺激淋巴細胞轉化等。實驗[8]表明，PGPIPN也可通過下調Bcl2去誘導卵巢癌凋亡。研究[3]表明PGPIPN不能抑制小鼠永生化成纖維細胞MEFS以及正常人肝細胞LO2的生長。

圖5 不同濃度的PGPIPN聯合DDP對人原代卵巢癌細胞凋亡的影響

A：正常對照組；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN；與10μg/mlDDP組比較：**P<0.01

圖6 不同濃度PGPIPN聯合DDP對人原代卵巢癌周期的影響

A：正常對照組；B：10μg/mlDDP；C：10μg/mlDDP+10-6mg/mlPGPIPN；D：10μg/mlDDP+10-4mg/mlPGPIPN；E：10μg/mlDDP+10-2mg/mlPGPIPN

本研究顯示不同濃度的PGPIPN與相同濃度的DDP共同作用于人原代卵巢癌細胞后，增殖抑制作用比單獨用藥強且呈時間劑量依賴關系。細胞遷移能力也顯著低于單獨用藥組。細胞的凋亡率隨著PGPIPN濃度的遞增而逐漸增高，表明PGPIPN有協同DDP的作用，可以促進人原代卵巢癌細胞的凋亡。實驗結果表明，PGPIPN可以增強順鉑對人原代卵巢癌細胞作用，增強卵巢癌對順鉑的敏感性。因此可以降低順鉑的用量，進而降低化療藥物的毒副作用。但具體相關機制還需進一步的研究，其機制可能與STATs有關。研究[9-11]已證實STAT3與卵巢癌、骨髓瘤、乳腺癌以及其它癌細胞的增殖、侵襲和轉移能力有關。研究[12]顯示STAT3通過影響CyclinD1的表達進而對細胞G1期進入S期產生影響。實驗[13]顯示，阻斷STAT3通路能誘導耐藥腫瘤細胞凋亡， 其機制主要是通過STAT3影響Caspase家族成員的表達。

由于PGPIPN的低毒副作用并且來源廣泛，因此，其臨床應用前景比較廣闊，同時也為研發卵巢癌化療輔助藥物提供新的思路。

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ZhouJuan,LiuChen,GuFang,etal

(Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University,Hefei 230032)

Immunomodulating Peptide enhance the effect of DDP on ovarian cancer cells

Objective To observe the concomitant therapy effect of immunomodulating peptide(PGPIPN) and anti-cancer drug cisplatin(DDP) on the proliferation and migration of ovarian cancer cellsinvitro.Methods The inhibitory action of DDP with PGPIPN on the proliferation of primary ovarian cancer cells were detected by MTS. Apoptotic ratios and cell cycle of primary ovarian cancer cells were measured by flow cytometry. Cell scratch assays were carried out to test cells′migration.Results The result of MTS showed that the inhibition rate of the concomitant group against ovarian cancer cells was significantly higher than the group treated only with DDP. The difference was significant(P<0.05) and in a dose and time dependent manner. Flow cytometry results showed that PGPIPN could promote the apoptosis of human primary ovarian cancer cells by DDP, and the cycle of cells was arrested in G0/G1 phase.Cell scratch assays showed that concomitant therapy significantly inhibited cell movement, of which the difference from the group treated only with DDP of statistical significance(P<0.05).Conclusion PGPIPN can improve the effect of DDP on primary ovarian cancer cells.

human primary ovarian cancer cells; drug combination; PGPIPN; DDP

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.010.html

2016-05-19接收

國家自然科學基金(編號：81472448)

1安徽醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，合肥 230032

2安徽醫科大學第一附屬醫院婦產科，合肥 230022

周 娟，女，碩士研究生；

秦宜德，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:yideqin@ahmu.edu.cn

R73-351；R595.479.1；R979.1

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.010