高壓氧預處理對大鼠腦梗死后腦水腫的影響及機制研究

卞合濤，初建峰

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高壓氧預處理對大鼠腦梗死后腦水腫的影響及機制研究

卞合濤，初建峰

目的 探討高壓氧預處理對大鼠腦梗死后腦水腫的影響及可能機制。方法 選擇SD大鼠96只,隨機分為假手術組、模型組、高壓氧預處理組，每組各32只。采用大腦中動脈線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型，在腦缺血后24、72 h進行神經功能評分；在腦缺血后72 h處死動物取出腦組織，檢測腦梗死側腦組織濕重干重比值(W/D)，利用TTC染色法計算腦梗死體積，利用Western blot法檢測腦梗死側腦組織白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達。結果 腦梗死后24 h和72 h，高壓氧預處理組與模型組比較，大鼠神經功能評分明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，高壓氧預處理組在腦缺血后72 h腦梗死體積、腦水腫明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，高壓氧預處理組在腦缺血后72 h IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達明顯降低(P<0.05)。結論 高壓氧預處理可能通過抑制IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達，保護血腦屏障的完整性，減輕腦梗死后腦水腫。

腦梗死；高壓氧；腦水腫；基質金屬蛋白酶9

腦卒中目前已成為人類第二位死因，有發病率高、致殘率高和致死率高等特點，其中缺血性腦卒中約占腦卒中的80%。溶栓治療是目前較為肯定和有效的方法[1]，但溶栓治療有嚴格的時間窗限制，僅有少部分患者獲益。因此針對缺血性腦卒中的發病機制，選擇性地研究新的治療方法至關重要。腦組織缺血后，缺血區發生一系列炎癥反應，加重血腦屏障的破壞，促使腦水腫的形成，導致顱內壓升高，嚴重影響患者的預后。白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factior-α,TNF-α)被認為是炎癥反應的重要因子?；|金屬蛋白酶9( matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的增加被認為參與了血腦屏障的破壞，加重了腦水腫的形成[2]。研究[3]表明高壓氧預處理可誘導腦缺血耐受，減少梗死面積，改善神經功能缺損癥狀，但具體機制不明確。該研究擬觀察高壓氧預處理對腦梗死后腦水腫的影響及檢測腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9的變化，探討高壓氧預處理對腦梗死后腦水腫的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 兔抗大鼠MMP-9、兔抗大鼠IL-1β、兔抗大鼠TNF-α(英國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記物山羊抗兔lgG抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；高壓氧艙(武漢船舶設計院)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京康為公司)。

1.2 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠，重(250±10) g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，手術前后動物自由進食和進水，室溫保持(24±1) ℃。實驗前隨機將動物分為假手術組(n=32)、模型組(n=32)、高壓氧預處理組(n=32)。

1.3 高壓氧預處理方法 高壓氧預處理組大鼠在大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型前放于高壓氧艙內連續預處理5 d。實驗前利用高濃度氧洗艙，將大鼠放于高壓氧艙內，開始時利用15 min勻速加壓至0.1 MPa，高壓持續60 min，15 min勻速減壓至艙內正常壓力，艙內溫度保持在(24±1) ℃，1次/d，連續5 d。末次高壓氧處理后3 h建立MCAO模型。

1.4 MCAO模型建立 采用文獻[4]報道的線栓法建立MCAO模型，大鼠用100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上，頸部皮膚用碘伏消毒，頸正中線切口2 cm左右，分離兩側甲狀腺，暴露氣管右側與胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌間的三角區，游離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，從頸總動脈插入多聚左旋賴氨酸處理過的直徑為0.26 mm的線栓，插入深度約為18 mm時產生阻擋感，停止插入。然后結扎、縫合，缺血120 min后輕柔拔出線栓5 mm并固定于皮下。

1.5 大鼠神經功能評分 采用大鼠神經功能缺損評分[5]，在腦梗死后的24、72 h對各組大鼠進行神經功能評分，包括感覺、運動、反射、平衡等方面進行。

1.6 腦梗死體積檢測 大鼠腦梗死72 h后完成神經功能評分，斷頭處死，迅速將取出的腦組織置于-20 ℃冰箱，5 min后置室溫切除嗅球、小腦和低位腦干后，放置于腦槽，切成5個厚約1.5 mm大腦連續冠狀切片。然后迅速將腦片置于10 ml、含1% TTC的PBS緩沖溶液中，37 ℃恒溫避光孵育30 min。經TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。取出腦片多聚甲醛溶液固定過夜拍照。應用IPP 6.0圖像分析系統軟件計算腦梗死體積，梗死體積百分比(%)=(正常側大腦半球體積-梗死側非梗死區大腦半球體積)/正常側大腦半球體積×100%，然后Image J軟件進行圖片分析。

1.7 腦水腫檢測 腦梗死后72 h進行神經功能評分后，每組各取8只大鼠處死。取缺血側腦組織稱濕重，包上錫箔紙，放入100 ℃烤箱中烤48 h，取出腦組織，電子秤測重量，記為腦組織干重。按照腦組織含水量監測(干濕重法)：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 Western blot法檢測腦梗死側腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達變化 腦梗死后72 h進行神經功能評分后，各實驗組分別取8只大鼠腦梗死側腦組織，加入適量組織裂解液，勻漿后離心(12 000 r/min、10 min)，提取蛋白，進行蛋白定量。測定總蛋白含量，分裝后-20 ℃保存。電泳，轉膜，封閉，加入IL-1β、TNF-α、MMP-9一抗，4 ℃孵育過夜；漂洗3次，每次10 min，分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗；室溫孵育1.5 h，PBS漂洗3次，每次5 min；以β-actin作為內參照，采用ECL化學發光法顯色。最后采用目的蛋白與內參灰度比值作為該目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 高壓氧預處理對MCAO模型大鼠神經功能評分的影響 與假手術組比較，模型組和高壓氧預處理組大鼠神經功能評分均明顯降低(F=260.54，P<0.05)；高壓氧預處理組與模型組比較，神經功能評分明顯升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 高壓氧預處理對腦缺血大鼠神經功能評分的影響

與同一時間點假手術組比較：*P<0.05；與同一時間點模型組比較：#P<0.05

2.2 高壓氧預處理對MCAO模型大鼠腦梗死體積的影響 與假手術組比較，模型組和高壓氧預處理組大鼠腦梗死體積均明顯升高(F=180.78，P<0.05)；高壓氧預處理組與模型組比較，大鼠腦梗死體積明顯降低(P<0.05)。見圖2。

2.3 高壓氧預處理對MCAO模型大鼠腦組織含水量的影響 與假手術組比較，模型組和高壓氧預處理組大鼠腦組織含水量均明顯升高(F=126.67，P<0.05)；高壓氧預處理組與模型組比較，大鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。見圖3。

2.4 高壓氧預處理對MCAO模型大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組和高壓氧預處理組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9表達均明顯升高(FIL-1=204.06，FTNF-α=235.71，FMMP-9=159.26，P<0.05)；高壓氧預處理組與模型組比較，大鼠腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9表達明顯降低(P<0.05)。見圖4。

3 討論

高壓氧預處理是指在高壓的環境下，提前給予高濃度的氧氣的一種干預方法。研究[6]證實高壓氧可減少梗死后缺血、低氧，有神經保護作用。本研究應用高壓氧預處理SD大鼠，建立腦梗死模型后進行神經功能評分，結果顯示高壓氧預處理能明顯改善大鼠腦梗死后神經功能評分。TTC染色結果進一步顯示，高壓氧預處理組腦梗死體積較模型組明顯減少，這與神經功能評分改變的結果相一致。但高壓氧預處理保護神經功能的具體機制仍不明確，可能與抗炎、抗凋亡、抑制氧化應激等有關。

圖2 高壓氧預處理對腦缺血大鼠腦梗死體積的影響

與同一時間點假手術組比較：*P<0.05；與同一時間點模型組比較：#P<0.05

圖3 高壓氧預處理對腦缺血大鼠腦梗死側腦水腫的影響

與同一時間點假手術組比較：*P<0.05；與同一時間點模型組比較：#P<0.05

腦水腫是腦梗死最嚴重的并發癥之一，可分為細胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫。腦缺血初期主要表現為細胞毒性腦水腫，隨著病情的發展，血管內皮細胞功能失調，血腦屏障破壞，形成血管源性腦水腫。目前臨床上對腦梗死后腦水腫的治療主要集中于腦水腫形成后的治療，而早期預防治療研究的較少。本研究應用高壓氧預處理SD大鼠制作腦梗死模型，72 h后利用干濕重法檢測腦梗死側腦水腫，結果顯示高壓氧預處理可明顯減少腦梗死后腦水腫。

圖4 高壓氧預處理對腦缺血大鼠腦梗死側腦組織IL-1β、TNF-α、MMP-9蛋白表達的影響

與同一時間點假手術組比較：*P<0.05；與同一時間點模型組比較：#P<0.05

腦梗死發生后梗死灶周圍產生一系列炎癥反應[7]，各種炎性因子得以釋放，導致白細胞在缺血區聚集，活化的白細胞可釋放大量的氧自由基、蛋白水解酶等物質，此類物質可進一步損傷血管，引起血管通透性升高，加重腦水腫的發生。在炎性級聯反應中，IL-1β和TNF-α起重要作用。IL-1β屬于白細胞介素，可通過吸引白細胞，引起炎癥介質的釋放，促發炎癥反應。TNF-α是腫瘤壞死因子，其可以促進T細胞產生各種炎癥因子，進而促進炎癥反應的發生。研究[8]顯示，在MCAO模型中，高壓氧預處理可通過抑制炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達減輕炎癥反應。

MMP是基質金屬蛋白酶類，其是一類鋅依賴中性蛋白酶家族，有降解細胞外基質作用[9]。MMP-9是MMP家族的主要成員，可由血管內皮細胞等多種細胞合成，并以無活性酶原形式分泌。MMP-9在腦血管基底膜的降解中起重要作用。腦血管基底膜含有層黏連蛋白、硫酸乙酰肝素等，其大多數是MMP-9的底物[10]。已有研究[11]利用基因敲除的方法證實MMP-9基因缺失可引起血腦屏障的破壞。在正常腦組織內，MMP-9只有低水平的表達，在炎性反應促發下，由膠質細胞、白細胞、血管內皮細胞等分泌到細胞外間隙，可由氧自由基、血紅蛋白降解產物等激活，而降解腦血管基底膜成分，導致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫。研究[12]證實，炎癥因子IL-1β和TNF-α的釋放可激活MMP-9，破壞血腦屏障，促使血管通透性升高。

推測高壓氧預處理可以通過抑制炎性介質的釋放，降低血腦屏障通透性，減輕腦梗死后的腦水腫。本研究結果表明，大鼠腦梗死后梗死灶周圍IL-1β、TNF-α的水平明顯升高，提示腦梗死后其表達明顯上調。高壓氧預處理組與模型組比較，高壓氧預處理明顯降低了IL-1β、TNF-α、MMP-9的表達，同時減輕腦梗死后的腦水腫。推測高壓氧預處理可能在一定程度上通過抑制IL-1β、TNF-α的表達，減輕炎癥反應，進而抑制MMP-9的激活，降低血腦屏障的通透性，減輕了腦水腫。

綜上所述，高壓氧預處理減輕腦梗死后腦水腫的機制可能與抑制炎癥反應有關，本研究為臨床上應用高壓氧治療腦梗死后腦水腫提供一定的理論依據。

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Effect and mechanism for hyperbaric oxygen preconditioning to cerebral edema after infarction

Bian Hetao ,Chu Jianfeng

(DeptofNeurology,JiningClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity,JiningFirstPeople’sHospital,Jining272000)

Objective To observe the effect of hyperbaric oxygen preconditioning to cerebral edema and possibility mechanism. Methods 96 male rats were randomly divided into sham-operated group, model group and hyperbaric oxygen preconditioning group. Focal cerebral ischemia rat models were established by occluding the middle cerebral artery(MCAO). Neurological grades were tested 24 h,72 h after ischemia; infarct size was measured by TTC staining; the brain W/D was detected; expressions of interleukin-1β(IL-1β), tumor necrosis factior-α(TNF-α), matrix metalloproteinase 9(MMP-9) were detected by Western blot. Results As compared with those in the model group, hyperbaric oxygen preconditioning had significantly improved neurological scores at ischemia 24 h and 72 h(P<0.05). After ischemia 72 h, hyperbaric oxygen preconditioning group had significantly reduced brain infarct size and brain water content as compared with the model group(P<0.05). Hyperbaric oxygen preconditioning group had significantly reduced expressions of IL-1β, TNF-α, MMP-9 as compared with the model group(P<0.05). Conclusion Hyperbaric oxygen preconditioning significantly inhibites the expression of IL-1β,TNF-α,MMP-9 and maintains the integrity of blood brain barrier, thus, reduces the brain water content.

cerebral infarction；hyperbaric oxygen；cerebral edema；MMP-9

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.011.html

2016-05-30接收

國家自然科學基金(編號：81301012)；濟寧市醫藥衛生科技項目(編號：2013jnwk26)

安徽醫科大學濟寧臨床學院(濟寧市第一人民醫院)神經內科，濟寧 272000

卞合濤，男，碩士，醫師；

初建峰，男，碩士，副主任醫師，責任作者，E-mail:hetaobian@163.com

R 743.33

A

1000-1492(2016)10-1445-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.011