SBP1基因在涎腺腫瘤中的表達及相關(guān)性分析

李 偉，王銀龍，朱友明，陸婧雅，朱 麗，許旭東，汪 聰

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SBP1基因在涎腺腫瘤中的表達及相關(guān)性分析

李 偉1，王銀龍1，朱友明1，陸婧雅1，朱 麗2，許旭東1，汪 聰1

目的 研究硒結(jié)合蛋白1(SBP1)在涎腺腫瘤中的表達情況，明確其與涎腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 收集15組涎腺腫瘤及其瘤旁組織，提取組織內(nèi)RNA，采用實時熒光定量RT-PCR法檢測組織中SBP1的表達。設(shè)計及合成SBP1的shRNA序列，慢病毒轉(zhuǎn)染scc-3細胞，應(yīng)用MTT、細胞劃痕實驗檢測細胞增殖與遷移。結(jié)果 SBP1在涎腺腫瘤中的表達明顯低于正常涎腺組織(P<0.05)；劃痕試驗和MTT檢測顯示SBP1對腫瘤細胞的增殖與遷移起抑制作用。結(jié)論 SBP1在涎腺腫瘤組織中低表達，具有抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。可作為涎腺腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷的早期指標。

涎腺腫瘤；硒結(jié)合蛋白1；增殖；遷移

涎腺腫瘤約占頭頸部腫瘤的3%～6%，其腫瘤細胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和生物學行為具有多樣性，涎腺腫瘤也比較多樣及復雜，臨床療效難以預(yù)料[1]。研究[2]顯示硒元素具有顯著抗癌和預(yù)防癌癥的效果。硒元素在體內(nèi)是以硒蛋白質(zhì)的形式存在，其中，硒結(jié)合蛋白1(Selenium binding protein 1,SBP1)被認為是硒元素抑癌作用的重要載體。人硒結(jié)合蛋白1

(SBP1)位于染色體lq21-22上，是一種特殊的含硒蛋白質(zhì)，能夠促進腫瘤細胞的凋亡。研究[3]表明SBP1在許多腫瘤組織中表達下調(diào)，這提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)。目前，SBP1在涎腺腫瘤發(fā)生中的作用的相關(guān)研究較少。該研究選用人舌鱗狀細胞癌scc-3細胞系，檢測SBP1對其遷移與增殖的影響，選取15組良性涎腺腫瘤和正常涎腺組織，檢測SBP1的表達水平。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人舌癌鱗狀細胞株scc-3由安徽醫(yī)科大學口腔實驗室提供。DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)。

1.2 標本來源 組織來源：隨機選取2014年5月～2015年5月安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和安徽省口腔醫(yī)院頜面外科經(jīng)手術(shù)切除、病理證實的涎腺病變組織15例，及手術(shù)中切除的病變涎腺組織10 mm以外的正常涎腺組織15例。所有涎腺腫瘤患者為在院初診患者，即之前未做過局部擴大切除手術(shù)，并且術(shù)前均未進行過放療、化療等治療，病例組除涎腺腫瘤外，無其他系統(tǒng)性疾病。組織處理方法：將獲取的組織樣品置于凍存管內(nèi)，并用記號筆標記編號。標本存置于液氮罐中保存待用。做好登記組織樣品的詳細內(nèi)容，如組織類型、編號、日期以及患者的基本資料。

1.3 材料與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、10%胎牛血清(美國HyClyone公司)；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、QRT反應(yīng)試劑盒(日本TaKaRa公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國Axygen公司)；RNA抽提試劑TRIzol、細胞裂解液(上海碧云天公司)；構(gòu)建載體所用的大腸桿菌Dh5α、病毒包裝細胞系293T(安徽醫(yī)科大學口腔實驗室)；沉默SPB1(shSBP1)(美國Sigma公司)；限制性內(nèi)切酶EcoR I和 Xba I(英國Invitrogen公司)；24、12、6孔板(美國Corning Costar公司)；無水乙醇、異丙醇(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) scc-3細胞株、293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，常規(guī)加入青霉素和鏈霉素，置5% CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長情況，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.4.2 過表達SBP1的構(gòu)建及目的基因擴增 在Pubmed上檢索人源性的SBP1的Nucleotide核苷酸序列，檢索到SBP1的CDS序列后，利用DNA club軟件設(shè)計出SBP1的基因序列，SBP1上游引物：5′-GCGAATTCATGCCAACAGGCCTGGTCAGG-3′，下游引物：5′-GCACGCGTCTAGACATCCTCTTCTGCATCT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。限制性內(nèi)切酶為EcoR I：GAATTC；Xba I：TCTAGA。將含有待擴增序列的DNA為模板進行PCR反應(yīng)，30 μl總體積包括：上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，2×Pfu PCR MasterMix 15 μl，無菌蒸餾水12 μl。在PCR擴增儀上完成PCR擴增。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，完成30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，置于4 ℃保溫。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果經(jīng)紫外監(jiān)測儀觀察，并將目的條帶進行產(chǎn)物回收。

1.4.3 質(zhì)粒的擴增和提取 將設(shè)計引物時設(shè)計的限制性內(nèi)切酶37 ℃水浴酶切相應(yīng)DNA片段和表達載體，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并產(chǎn)物回收后，回收后的酶切產(chǎn)物和載體在T4連接酶下連接1 h后轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌Dh5α，次日手抽酶切驗證，并通過測序獲得含有SBP1片段載體的大腸桿菌Dh5α菌株。

1.4.4 shSBP1病毒的包裝及感染 2 μg PLKO.1空載或PLKO.1-SBP1、2 μg pREV、2 μg pGag和1 μg pVSVG轉(zhuǎn)染入生長在6孔板中的HEK 293T細胞中，用純DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后更換含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收集含有病毒的培養(yǎng)基上清液，上清液用0.45 μm PVDF 濾頭(Millipore)過濾。過濾后含有病毒的培養(yǎng)基上清分別感染scc-3細胞，同時加入4 μg/ml polybrene(美國Sigma公司)，37 ℃孵育24 h后更換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并加入5 μg/ml puromycin篩選細胞24 h。

1.4.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取處于對數(shù)生長期的慢病毒感染的scc-3細胞，5×105個/每孔，均勻接種于6孔板，分為正常組、shSBP1組、SBP1過表達組，24 h后待細胞長至90%，用滅菌的移液器槍頭，在培養(yǎng)板底部均勻劃出兩條劃痕，然后用PBS洗去被劃下的細胞，并以此時間點作為0 h，細胞用hochest染色后，0、24、48 h時用熒光顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并進行拍照、比較。

1.4.6 MTT法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的scc-3細胞，分為正常組、shSBP1組、SBP1過表達組，2 000個/每孔均勻接種于96孔板，每孔加入體積200 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組設(shè)3個復孔，用倒置顯微鏡觀察細胞情況，待細胞貼壁后，按時間梯度加入藥物，加入20 μl MTT溶液(終濃度為5 g/L),37 ℃孵育4 h后吸走上清液，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 min，用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀測定各孔吸收值，繪制細胞生長曲線。

1.4.7 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應(yīng)(qRT-PCR)檢測SBP1 mRNA的表達水平 總RNA提取及cDNA合成：取100 mg冷凍的涎腺腫瘤組織及瘤旁組織，用組織剪剪碎，TRIzol法獲取組織總RNA。取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩RT-PCR法檢測SBP1 mRNA的相對表達水平，SBP1及內(nèi)參β-actin的引物經(jīng)GenBank檢索引物序列并設(shè)計合成。擴增條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳后紫外燈下觀察電泳條帶并進行拍照。

2 結(jié)果

2.1 SBP1對細胞遷移的影響 SBP1被認為是硒元素抑癌作用的重要載體，通過劃痕實驗可以看出當培養(yǎng)48 h后正常組與SBP1過表達組比較，細胞向中間遷移速度明顯較快(圖1A)，而在scc-3腫瘤細胞株中沉默SBP1時，24 h后shSBP1組向中間遷移的速度明顯快于正常組(圖1B)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。過表達SBP1可抑制細胞遷移，而敲低SBP1明顯促進細胞的遷移，說明SBP1具有抑制細胞遷移的能力。

圖1 劃痕試驗檢測SBP1對腫瘤細胞遷移能力的影響

A：scc-3腫瘤細胞分別感染正常組和SBP1過表達組，48 h后觀察和比較兩組細胞的遷移能力；B：scc-3腫瘤細胞分別感染正常組和shSBP1組，24 h后觀察和比較兩組細胞的遷移能力

2.2 SBP1對細胞增殖的影響 通過MTT實驗檢測不同SBP1表達程度時scc-3的生長曲線，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，48 h后，正常組較SBP1過表達組細胞增殖能力明顯較高(圖2A)，而在scc-3腫瘤細胞株中沉默SBP1時，shSBP1組細胞增殖能力則明顯高于正常組(圖2B)。過表達SBP1可抑制腫瘤細胞增殖，而敲低SBP1則促進腫瘤細胞增殖。說明SBP1具有抑制細胞增殖的能力。

圖2 MTT法檢測SBP1對腫瘤細胞增殖能力的影響

A：scc-3腫瘤細胞分別感染正常組和SBP1過表達組，檢測不同時間段scc-3腫瘤細胞的活性；B：scc-3腫瘤細胞分別感染正常組和shSBP1組，檢測不同時間段scc-3腫瘤細胞的活性；與正常組比較：*P<0.05

2.3 SBP1在涎腺腫瘤組織的表達 應(yīng)用qRT-PCR法檢測15對良性涎腺腫瘤組織和瘤旁組織中SBP1 mRNA的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。11例腫瘤組織SBP1 mRNA的表達水平均低于相應(yīng)的瘤旁組織，4例腫瘤組織SBP1 mRNA的表達水平則高于相應(yīng)的瘤旁組織。表明在涎腺腫瘤組織中，SBP1的表達水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。見圖3。

3 討論

腫瘤指在各種致瘤因素的作用下，機體局部組織的細胞在基因水平上無法調(diào)控自身的生長過程，導致單克隆性異常增生而形成的新生物。涎腺腫瘤約占口腔頜面部腫瘤的20%，發(fā)病率較高，并不斷上升。涎腺腫瘤細胞的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和生物學行為比較復雜，涎腺腫瘤種類也比較多樣[4]，臨床療效較差。因缺乏特異性的早期檢測涎腺腫瘤的生物學標記，難以做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。

圖3 涎腺腫瘤組織中SBP1的表達1～15：涎腺腫瘤和瘤旁組織標號

學者們對涎腺腫瘤的發(fā)病機制進行大量研究，認為腫瘤的發(fā)生可能與體內(nèi)某些元素的缺失有關(guān)，硒元素是其中的一種。硒是人體內(nèi)具有抗癌活性的微量元素，SBP1是一種與其他含硒蛋白質(zhì)有明顯差異的特殊的蛋白。SBP1參與了細胞周期的調(diào)控，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。與正常組織比較，SBP1在前列腺癌[5]、胃癌[6]、結(jié)直腸癌[7]等組織中表達明顯減少。大量學者認為SBP1的表達變化可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要事件，SBP1對細胞周期進行調(diào)控，抑制腫瘤細胞生長，其表達減少可能是正常細胞向腫瘤細胞轉(zhuǎn)化的過程。研究[8]顯示SBP1通過阻止過氧化物對DNA的損傷，增加p53和COX-2的表達，從而改變DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成，阻止癌細胞的生長等。研究[9]表明SBP1的表達受到低氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α)的調(diào)控，HIF-1α在低氧條件下表達增高并誘導多種靶基因表達，進而調(diào)節(jié)細胞增殖、血管新生和重構(gòu)。

腫瘤發(fā)生的過程是多階段并逐步演進，細胞通過一系列進行性的改變向惡性發(fā)展[10-11]。本研究MTT檢測結(jié)果顯示SBP1基因的表達，使腫瘤細胞的增殖能力受到抑制。劃痕試驗結(jié)果顯示SBP1的表達使腫瘤細胞的遷移能力受到抑制。說明SBP1可能參與腫瘤細胞周期的調(diào)控。

涎腺腫瘤組織中SBP1的表達水平顯著低于瘤旁組織。提示：① SBP1與涎腺腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能在一定程度上抑制了涎腺腫瘤的發(fā)生及發(fā)展；② SBP1可能是涎腺組織中的生理蛋白，但是處于激活狀態(tài)，一旦體內(nèi)特定通路遭到抑制，便誘導了腫瘤的發(fā)生；③ SBP1可作為涎腺腫瘤的腫瘤標志物，進一步研究在不同的涎腺腫瘤中的表達量，對腫瘤作出明確診斷；④ 可以探尋SBP1基因失活的通道，進行早期干預(yù)，阻止腫瘤的發(fā)生發(fā)展；⑤ 本研究顯示并非所有的腫瘤組織中SBP1都呈低表達，說明在涎腺腫瘤的發(fā)生過程中SBP1是其發(fā)生的一個重要因素，但是并不是導致涎腺腫瘤發(fā)生的唯一原因，與SBP1無關(guān)因素在涎腺腫瘤發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用，涎腺腫瘤的發(fā)生是多種因素綜合產(chǎn)生的結(jié)果，這也是日后研究的重點。

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Expression of SBP1 gene in salivary gland tumor

Li Wei,Wang Yinlong,Zhu Youming,et al

(DeptofOralandMaxillofacialSuger,TheAffiliatedStomatologyHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

Objective Selenium binding protein 1 (SBP1) located on chromosome lq21-22, a kind of special selenium protein,can promote the apoptosis of tumor cells.To discuss the expression of human SBP1 and to clarify its relationship with the occurrence, development, invasion and metastasis in salivary gland tumor. Methods The salivary gland tumor tissues (n=15) were collected and their mRNA was abstracted. The relative expression of SBP1 was quantified by SYBR Green real-time PCR. SBP1 lentivirus were transfected into scc-3 cells after designing shRNA SBP1 sequence.The proliferation and growth ability of SBP1 were detected by MTT test respectively,and migration ability was detected by cell scratch assay. Results The positive rates of expression of SBP1 were significantly lower in tumor tissues (P<0.05). SBP1 inhibited tumor cell proliferation and migration ability. Conclusion The expressions of SBP1 in salivary gland tumor and peritumoral tissue are different.Low expression of SBP1 may inhibit tumor cell proliferation and migration ability.It is a reliable marker of earlier period diagnosis and prognosis of the salivary gland tumor.

salivary gland tumor; selenium binding protein 1; proliferation; metastasis

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.012.html

2016-06-12接收

國家自然科學基金(編號：31501103)；安徽省自然科學基金(編號：1508085QC62)

1安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，合肥 230032

2安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，合肥 230601

李 偉，女，碩士研究生；

王銀龍，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:wangylah@sina.com

R 739.8

A

1000-1492(2016)10-1449-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.012