成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細(xì)胞標(biāo)志物分布、表達(dá)量的比較研究

王 鑫，陳曉蓉

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成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細(xì)胞標(biāo)志物分布、表達(dá)量的比較研究

王 鑫，陳曉蓉

目的 比較成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細(xì)胞標(biāo)志物p63、角蛋白19和β1整合素的分布和表達(dá)量的差異，為后續(xù)的皮膚組織工程學(xué)研究提供客觀的參照。方法 分別取8只成年裸鼠與野生型小鼠背部皮膚，制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察皮膚表皮、真皮和皮膚附屬器的形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)法檢測p63、角蛋白19和β1整合素在兩種鼠皮膚的分布和表達(dá)量。結(jié)果 HE染色低倍鏡下裸鼠表皮較野生型小鼠厚，高倍鏡下裸鼠表皮由3～4層上皮細(xì)胞組成，而野生型小鼠表皮由1～2層上皮細(xì)胞組成。裸鼠表皮基底層細(xì)胞呈立方形或者矮柱形，細(xì)胞核深染，呈卵圓形，居中，野生型小鼠表皮基底層細(xì)胞呈立方形，細(xì)胞核圓形深染。裸鼠表皮有明顯的顆粒層，而野生型小鼠表皮則無。裸鼠皮脂腺?zèng)]有野生型小鼠皮脂腺發(fā)達(dá)；免疫組織化學(xué)顯示p63表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠毛囊和表皮基底層細(xì)胞的胞核中，角蛋白19表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細(xì)胞中，β1整合素表達(dá)于裸鼠皮膚毛囊和表皮顆粒層細(xì)胞中及野生型小鼠毛囊中；裸鼠p63、β1整合素和角蛋白19的表達(dá)量少于野生型小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 成年裸鼠與野生型小鼠皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)及表皮干細(xì)胞標(biāo)志物的分布和表達(dá)量存在差異，可以作為區(qū)別裸鼠與野生型小鼠皮膚的參考。

比較組織學(xué)；免疫組織化學(xué)；表皮干細(xì)胞

裸鼠目前是生物醫(yī)學(xué)研究不可或缺的模型鼠，除應(yīng)用于腫瘤學(xué)、毒理學(xué)、藥品和生物制品安全性評(píng)價(jià)和篩選的研究中[1]，又因與野生型小鼠相比，存在免疫缺陷，可以作為移植皮膚的受體，廣泛應(yīng)用于皮膚組織工程學(xué)研究中，并可用此模型研究相關(guān)皮膚疾病的病因及發(fā)生發(fā)展[1-2]。該研究將對裸鼠和野生型小鼠的皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致觀察，通過對表皮干細(xì)胞標(biāo)志物p63、角蛋白19及β1整合素[3]進(jìn)行標(biāo)記，觀察3種標(biāo)志物在裸鼠和野生型小鼠皮膚的分布及計(jì)算其表達(dá)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探討兩者存在的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡健康SPF級(jí)成年裸鼠(Balb/c-nu)，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雌雄不限，19～21 g、安徽動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心21～23 ℃室溫?zé)o菌條件下飼養(yǎng)，飼料和水均消毒滅菌，飼養(yǎng)1周后處死。選取8周齡健康SPF級(jí)昆明野生型小鼠，購自安徽省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雌雄不限，15～18 g，自由采食，飼養(yǎng)1周后處死。本實(shí)驗(yàn)在處理動(dòng)物過程中遵循安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理章程。

1.2 主要儀器與試劑 RM2135石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)；BM-Ⅱ石蠟包埋機(jī)(安徽電力科學(xué)研究所)；日本OLYMPUS顯微鏡BX53(日本OLYMPUS公司)；85-1恒溫磁力攪拌器(常州國華電器有限公司)；ZT-12P 型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)；QP-B1 型切片漂烘溫控儀(安徽電子科學(xué)研究所)；4 ℃～-20 ℃冰箱(合肥美菱冰箱廠)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(美國 Media Cybernetics公司)；兔抗鼠p63(ab109126)、角蛋白19(ab52625)和β1整合素(ab52971)抗體購自美國Abcam公司；二抗檢測試劑盒(PV-6001)、DAB顯色劑(ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 取材和制作切片 ① HE染色：取裸鼠和野生型小鼠背部皮膚，10%甲醛溶液固定、脫水、透明、包埋、切片、烤片、脫蠟復(fù)水、HE染色、封片，觀察結(jié)果；② 免疫組織化學(xué)染色：取裸鼠和野生型小鼠背部皮膚，10%甲醛溶液固定，脫水、透明、包埋、切片、烤片、脫蠟復(fù)水后放檸檬酸鹽液中，微波爐中高火進(jìn)行抗原熱修復(fù)，雙氧水孵育，分別加入一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，室溫靜置1 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，觀察結(jié)果。

1.4 圖像分析 Nikon DXM1200F 400倍鏡下攝像，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0測算3種標(biāo)志物陽性表達(dá)的累積光密度，再除以選定面積，算出平均光密度(mean optical density, MOD)值，MOD值越大，標(biāo)志物表達(dá)量越多。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 裸鼠和野生型小鼠皮膚經(jīng)HE染色結(jié)果顯示均由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成。低倍鏡下裸鼠表皮明顯厚于野生型小鼠。裸鼠和野生型小鼠的表皮與真皮連接處結(jié)構(gòu)比較相似，都相對平整。裸鼠和野生型小鼠的皮下組織中均可見縱切橫紋肌(M)，見圖1A、1D。

高倍鏡下裸鼠表皮由3～4層上皮細(xì)胞組成，而野生型小鼠表皮由1～2層上皮細(xì)胞組成，兩者在基底細(xì)胞和基底上層細(xì)胞有形態(tài)學(xué)差異，裸鼠基底層細(xì)胞(圖1B黃色箭頭所指)呈立方形或者柱狀，細(xì)胞核深染，呈卵圓形，居中；野生型小鼠基底層細(xì)胞(圖1E藍(lán)色箭頭所指)呈立方形，細(xì)胞核圓形深染?；咨蠈蛹?xì)胞裸鼠有明顯的顆粒層，但細(xì)胞輪廓不清晰，可見濃染顆粒，而野生型小鼠沒有，裸鼠真皮膠原纖維(CF)(圖1B、1E)豐富，較野生型小鼠發(fā)達(dá)。

裸鼠毛囊(HF)染色較深，毛根(HR)發(fā)育不良，與毛囊融為一體，無突出表皮的毛干；而野生型小鼠毛囊染色較淺，毛根發(fā)育正常，毛干突出表皮，同時(shí)裸鼠和野生型小鼠均未見立毛肌和汗腺結(jié)構(gòu)。見圖1A、1D。

野生型小鼠皮脂腺較裸鼠皮脂腺發(fā)達(dá)。高倍鏡下顯示裸鼠皮脂腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)染色略深，核較大，染色略深，可見雙核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞腺體周邊的細(xì)胞與中心的細(xì)胞差別不大。野生型小鼠皮脂腺細(xì)胞胞質(zhì)染色較淺，核小，且腺體細(xì)胞形態(tài)由腺體外周向腺體中心呈漸進(jìn)性固縮狀態(tài)。見圖1C、1F。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 p63表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠毛囊和表皮基底層細(xì)胞的胞核中，角蛋白19表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細(xì)胞中，β1整合素表達(dá)于裸鼠皮膚毛囊和表皮顆粒層細(xì)胞中及野生型小鼠毛囊中，裸鼠p63、β1整合素和角蛋白19的表達(dá)量少于野生型小鼠(P<0.01)。見圖2、表1。

表1 成年裸鼠與野生型小鼠p63、角蛋白19、β1整合素MOD值的比較

圖1 HE染色示裸鼠及野生型小鼠皮膚

A、B、C：裸鼠皮膚；D、E、F：野生型小鼠皮膚；HF：毛囊；HR：毛根；EP：表皮；CF：膠原纖維；M：橫紋肌；SG：皮脂腺；N：細(xì)胞核；A、D：×100；B、C、E、F：×400

圖2 免疫組織化學(xué)染色示裸鼠及野生型小鼠皮膚 ×400

3 討論

研究[4]表明野生型小鼠由于有豐密的毛發(fā)作為保護(hù)層，大大減弱了環(huán)境對其造成的表皮磨損，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明裸鼠體表光滑，其表皮較野生型小鼠厚，可能是為了應(yīng)對皮膚在環(huán)境中受到的磨損，保護(hù)自身免受傷害，皮膚相應(yīng)增厚，而真皮作為向表皮提供營養(yǎng)來源的結(jié)構(gòu)，為了給相對較厚的表皮提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相應(yīng)增厚；動(dòng)物模型表皮較薄，顆粒層不連續(xù)甚至缺如。本研究結(jié)果表明，裸鼠表皮含有一層顆粒層細(xì)胞，細(xì)胞輪廓不清晰，HE染色可見濃染藍(lán)色顆粒，而野生型小鼠則沒有顆粒層細(xì)胞，說明裸鼠由于環(huán)境的影響，產(chǎn)生了與人類皮膚類似的顆粒層，增強(qiáng)了皮膚抵抗外來損害的能力。

研究[4]表明，不同動(dòng)物之間的皮脂腺結(jié)構(gòu)和腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)果一般差別不大。本研究顯示，與裸鼠皮脂腺相比，野生型小鼠皮脂腺較為發(fā)達(dá)，說明野生型小鼠皮脂腺細(xì)胞分化較為成熟，而裸鼠皮脂腺細(xì)胞核大，細(xì)胞有的具有雙核，其成熟程度低于野生型小鼠。主要原因可能是裸鼠作為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在人工的飼養(yǎng)環(huán)境中其生活環(huán)境單一，導(dǎo)致了皮脂腺的退化。動(dòng)物毛發(fā)對保護(hù)皮膚免受損害有重要作用，毛由伸出皮外的毛干和埋入皮膚中的毛根構(gòu)成[4-5]。本研究 HE 染色結(jié)果顯示，裸鼠毛囊染色較深，毛根發(fā)育不良，導(dǎo)致毛干不能突出表皮，使裸鼠呈現(xiàn)光滑無毛狀態(tài)，具體原因有待實(shí)驗(yàn)一步探究。

研究[6-8]表明，從角膜和皮膚組織中分離得到了表皮細(xì)胞，通過檢測其p63的表達(dá)和克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)在全克隆細(xì)胞中p63高表達(dá)，而亞克隆細(xì)胞則不表達(dá)，因此p63可作為區(qū)分表皮干細(xì)胞和其他體細(xì)胞的標(biāo)記基因。p63的缺失可直接導(dǎo)致表皮基底層干細(xì)胞缺乏。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p63表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠毛囊和基底層細(xì)胞的胞核中，但是裸鼠p63的表達(dá)量少于野生型小鼠，可能原因是野生型小鼠表皮干細(xì)胞的活力較裸鼠高。

研究[9-11]表明β1整合素在表皮基底層部分細(xì)胞中表達(dá)，β1整合素是層黏連蛋白和膠原蛋白受體，這些細(xì)胞能夠通過Ⅳ型膠原快速科學(xué)儀黏附法進(jìn)行富集，并有全克隆生長特點(diǎn)，因此β1整合素可以作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示β1整合素在裸鼠毛囊和表皮顆粒層均有表達(dá)，而在野生型小鼠皮膚中僅僅表達(dá)在毛囊中，表明在裸鼠和野生型小鼠毛囊間表皮干細(xì)胞并不表達(dá)β1整合素，但β1整合素作為表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物為何會(huì)表達(dá)在裸鼠顆粒層，有待進(jìn)一步探究。本研究顯示在裸鼠毛囊和表皮顆粒層細(xì)胞中表達(dá)的β1整合素量少于野生型小鼠毛囊中的β1整合素的表達(dá)量，推測野生型小鼠表皮中的細(xì)胞總體的增殖能力要強(qiáng)于裸鼠，由于野生型小鼠的皮膚較薄，細(xì)胞庫的細(xì)胞基數(shù)較小，為保證毛發(fā)的完整以及質(zhì)量，因此表皮細(xì)胞需要保持較高的活力來為細(xì)胞更新?lián)Q代。

研究[12]表明[3H]胸苷標(biāo)記滯留的細(xì)胞被鑒別為表皮干細(xì)胞，在毛囊外根鞘區(qū)應(yīng)用免疫酶雙標(biāo)法同時(shí)標(biāo)記[3H]胸苷和角蛋白19，發(fā)現(xiàn)[3H]胸苷陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)角蛋白19，表明角蛋白19是毛囊干細(xì)胞的一種標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示角蛋白19表達(dá)于裸鼠和野生型小鼠皮膚毛囊和基底層細(xì)胞中，表明裸鼠和野生型小鼠皮膚中角蛋白19的分布無差異，但是野生型小鼠角蛋白19表達(dá)量要比裸鼠高，可能原因是裸鼠毛囊發(fā)育不良，導(dǎo)致裸鼠角蛋白19表達(dá)低于野生型小鼠。相比裸鼠，野生型小鼠表皮較薄，角質(zhì)層上的鱗屑在環(huán)境中流失快，需要更牢固的連接，角蛋白19需要有較高的表達(dá)。

裸鼠和野生型小鼠作為動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)中[1]，因此比較裸鼠和野生型小鼠皮膚的差異，有利于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒑蛣?chuàng)新，促進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)向臨床方向轉(zhuǎn)化；此外裸鼠和野生型小鼠在皮膚表皮、真皮及附屬器的形態(tài)和3種表皮干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)的差異反映了兩種表型小鼠的皮膚在生長發(fā)育過程中基因表達(dá)及調(diào)控的不同，究竟是哪些基因在生長發(fā)育過程中表達(dá)不同，需要進(jìn)一步的探索和研究。

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The comparative study of skin morphological structure and epithelial stem cell markers expression distribution, quantity between adult nude mice and wild-type mice

Wang Xin,Chen Xiaorong

(DeptofHistologyandEmbryology，SchoolofBasicMedicalScience，AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032)

ObjectiveTocomparethedifferencesofskinmorphologicalstructureandthedistribution,quantityofepithelialstemcellmarkersexpressionbetweenadultnudemiceandwild-typemice，andtoprovideanobjectivereferenceforsubsequentstudyofskintissueengineering.MethodsThedorsalskinwasobtainedfrom8adultnudemiceandwild-typemicerespectivelytomakeparaffinsections.Thenthemorphologyofepidermis,dermisandskinappendageswereobservedbyHEstainingunderlightmicroscope.Distributionandquantityofp63,β1integrinandkeratin19expressionweredeterminedbyimmunohistochemicalstaininginskin.ResultsTheepidermisofnudemicewasthickerthanthatofwild-typemiceunderlightmicroscopeatlowmagnification.Athighmagnification,epidermisofnudemiceconsisted3to4layersofepithelialcells,whilethatofwild-typemiceconsisted1to2layersofepithelialcells.Thecellsinstratumbasaleofnudemicewerecuboidalorshort-columnedandhadhyperchromaticovalnucleirestingatthecenterofcells,whereasinstratumbasaleofwild-typemice,theywereroundandthenucleiwerehyperchromaticandround.Thereexistedobviousstratumgranulosumintheepidermisofnudemice,whereastherewasnostratumgranulosumintheepidermisofwild-typemice.Thesebaceousglandsoftheadultnudemicewerelessdevelopedthanthatofwild-typemice.Immunohistochemistrystainingshowedthatp63wasexpressedinnucleiofstratumbasalandhairfolliclescellsofnudemiceandwild-typemice,keratin19instratumbasalandinhairfolliclescellsofnudemiceandwildtypemice,β1integrininstratumgranulosumlayerandhairfolliclescellsofnudemice,andinthehairfolliclescellsofwild-typemice.Thequantitiesofp63,keratin19,β1integrinexpressionofthenudemicewerelowerthanthatofwild-typemice,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).ConclusionThereexistdifferencesofskinmorphologicalstructureandthedistribution,quantityofepithelialstemcellmarkersexpressionthatcanbeas

fordistinguishingthetypeofskinbetweenadultnudemiceandwild-typemice.

comparativemorphology;immunohistochemistry;epithelialstemcell

時(shí)間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.014.html

2016-07-14接收

安徽省教育廳基金項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2007A034)

安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，合肥 230032

王 鑫，男，碩士研究生；

陳曉蓉，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxrzp@126.com

R 318.08

A

1000-1492(2016)10-1459-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.014