雙酚A誘導肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細胞聚集

李應配，羅時猛，冷銀芝，陸曉桐，張書雅，蔣建華，朱啟星，沈 彤,

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雙酚A誘導肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細胞聚集

李應配1，羅時猛1，冷銀芝1，陸曉桐2，張書雅2，蔣建華3，朱啟星4，沈 彤1,4

目的 研究飲水攝入低劑量雙酚A(BPA)誘導的肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細胞的聚集。方法 將4周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常飲食(ND)組和高脂飲食(HFD)組，每組再分別設溶劑對照組、10 nmol/L BPA組、100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組。小鼠經飲水攝取BPA，20周后稱量體重，處死，無菌取附睪脂肪墊，HE染色觀察脂肪組織炎性細胞浸潤，免疫組化法檢測脂肪組織IL-6的表達，流式細胞術分析脂肪組織血管基質成分(SVF)巨噬細胞比例。結果 與各自對照組比較，ND和HFD小鼠BPA暴露組體重和附睪脂肪墊系數明顯升高(P<0.05)，且隨BPA劑量的增加而上升(P<0.05)；BPA暴露組脂肪組織脂肪細胞體積和細胞間隙增大，間隙有炎細胞浸潤；BPA暴露可致脂肪組織炎性因子IL-6表達上調和附睪脂肪墊SVF中巨噬細胞比例明顯升高(P<0.05)。結論 低劑量BPA暴露可以誘導小鼠肥胖，而脂肪組織巨噬細胞的聚集可能與BPA誘導肥胖相關。

雙酚A；炎癥；脂肪組織巨噬細胞

雙酚A(bisphenol A，BPA)是制造環氧樹脂、聚碳酸酯等的單體，廣泛應用于食品包裝材料、飲料容器、生產牙套等塑料工業，已成為世界上年產量最大的化學制品之一。研究[1]報道人體多種生物樣本都可檢測到BPA，表明人類已廣泛暴露于環境BPA。動物實驗和人群研究[2-5]均表明BPA暴露與超重和肥胖顯著相關，但是具體機制尚不清楚。肥胖是一種全身慢性低度炎癥的病理狀態，在脂肪組織中有大量脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages，ATM)的浸潤，而且不斷聚集、激活，增加脂肪組織中炎癥因子分泌[6]。研究[7-8]顯示，BPA暴露可以下調巨噬細胞的活力，從而影響其功能。研究[9]表明BPA可以調控人類脂肪組織巨噬細胞中細胞因子的表達，影響炎性應答。但BPA誘導肥胖中脂肪組織巨噬細胞的聚集目前仍未見報道。該研究通過動物實驗，研究長期低劑量BPA暴露誘導肥胖小鼠中脂肪組織巨噬細胞的聚集，為闡明BPA與肥胖間關系提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 BPA(99.9%分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司)；二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(美國Sigma 公司)；BPA用DMSO溶解(DMSO終濃度不超過1%)；藻紅蛋白(phyocoerythrin, PE)-anti-F4/80抗體(美國Biolegend公司)；兔來源多克隆IL-6抗體(稀釋比1 ∶100)(武漢Elabscience生物公司)；通用型生物素(北京中杉金橋生物技術有限公司)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 實驗動物和處理 SPF級 4周雄性C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于清潔級動物房，自由進食，溫度維持在約25 ℃，12 h光照和12 h黑暗的晝夜環境。適應性飼養1周后隨機分為正常飲食(normal diet，ND，12%脂肪能量)組和高脂飲食(high fat diet，HFD，45%脂肪能量)組，每組分別設溶劑對照組、10 nmol/L BPA組、100 nmol/L BPA組和1 000 nmol/L BPA組，每組6只小鼠。小鼠經飲水攝入不同濃度的BPA，每天觀察小鼠狀態并記錄飲水量和飼料消耗量，每周稱體重1次。為保持飲水中BPA含量，每2 d換水1次。處理20周后稱量體重，處死小鼠，無菌取附睪脂肪墊并稱重。動物實驗經過安徽醫科大學實驗動物倫理委員會的批準，按照安徽醫科大學實驗動物規范進行。

1.3 組織病理學觀察附睪脂肪組織炎性細胞浸潤 取新鮮附睪脂肪組織，用4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，制成5 μm切片。脫蠟、HE染色、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察脂肪組織炎性細胞浸潤情況。

1.4 免疫組化法檢測附睪脂肪組織IL-6的表達 5 μm石蠟切片98 ℃燒烤30 min，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，3% H2O2于37 ℃中恒溫孵育20 min，50 μl/片正常山羊血清封閉，37 ℃恒溫孵育30 min，吸去血清，滴加50 μl兔來源多克隆IL-6抗體(稀釋比1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，室溫下復溫30～60 min，PBS洗3遍，每次5 min；滴加50 μl生物素山羊抗兔IgG工作液，37 ℃恒溫孵育10～15 min，PBS洗3遍，每次5 min，再滴加50 μl羊抗兔辣根酶標記二抗工作液，37 ℃恒溫孵育10～15 min，PBS充分清洗后，DAB顯色，蘇木精復染，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯徽鏡下觀察。在400倍下選取6個代表性視野，用ImagePro-Plus軟件計算每個視野中累積光密度值，求其平均值。

1.5 附睪脂肪墊基質血管碎片(stromal vascular fraction，SVF)的提取 取新鮮附睪脂肪組織，中性PBS沖洗3次，剪成碎片，在37 ℃水浴鍋中用4 ml的1 mg/ml II型膠原酶消化40 min，200 μm過濾網過濾，1 000 r/min離心8 min，吸去上面脂肪層，2 500 r/min離心10 min，倒去上清液，底層顆粒細胞即為SVF。

1.6 流式細胞術檢測SVF巨噬細胞比例 SVF細胞懸液[(1～10)×105/ml]中加入2 μl PE-抗小鼠F4/80抗體，震蕩后，常溫下避光孵育30 min，加3 ml PBS震蕩，1 500 r/min離心10 min,去除上層液體，加300 μl PBS，震蕩，Beckman Coulter流式細胞儀檢測，Flow Jo軟件分析巨噬細胞比例。

2 結果

2.1 飲水攝入不同濃度BPA對小鼠體重和附睪脂肪墊的影響 暴露20周后，HFD小鼠體重均高于ND小鼠，BPA暴露組ND和HFD小鼠體重和附睪脂肪墊系數均明顯高于各自對照組，且體重和附睪脂肪墊系數隨BPA濃度上升而增加。與對照組比較，ND小鼠和HFD小鼠在100 nmol/L 和1 000 nmol/L BPA處理時差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同劑量BPA暴露20周對小鼠體重和附睪脂肪墊系數的影響±s)

與相同飲食對照組比較：*P<0.05

2.2 飲水攝入BPA對小鼠附睪脂肪組織炎性細胞浸潤的影響 與ND小鼠比較，HFD小鼠脂肪細胞體積變大，細胞間隙增大，間隙有炎細胞浸潤。與各自對照組比較，BPA處理組隨著BPA劑量遞增，脂肪細胞體積和細胞間隙越來越大，間隙炎細胞浸潤也越來越明顯，見圖1。

2.3 飲水攝入BPA對小鼠脂肪組織IL-6表達的影響 免疫組化顯示，與ND小鼠比較，HFD小鼠脂肪組織IL-6表達明顯增強；與各自對照組比較，BPA處理組隨著BPA劑量遞增，IL-6表達逐漸增強，見圖2。

2.4 飲水攝入BPA對小鼠脂肪組織巨噬細胞比例的影響 流式細胞術分析附睪脂肪墊巨噬細胞的比例，結果顯示，與ND小鼠比較，HFD小鼠附睪脂肪墊巨噬細胞比例明顯升高(P<0.05,表中未顯示)。與各自對照組比較，在ND小鼠和HFD小鼠中BPA暴露組巨噬細胞比例都明顯升高，且均隨BPA劑量的升高而上升， ND小鼠和HFD小鼠在100 nmol/L 和1 000 nmol/L BPA處理時差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

BPA是一種典型的環境內分泌干擾物，在強酸、強堿、高溫等情況下，容易從塑料制品中釋放出來，通過消化道、呼吸道或皮膚等多種途徑進入人體[10]。本研究小鼠采用飲水攝入的方法暴露BPA，與人類的暴露途徑相似。美國環保署規定BPA的安全劑量為50 μg/(kg·d)，許多動物實驗都已經證實了低于這劑量的BPA仍然可以引起機體副作用。本研究BPA暴露最高劑量為1 000 nmol/L，即228.29 μg/L,如果小鼠每天飲水量為5 ml，也只有0.114 15 μg，遠低于規定的安全劑量。

表2 BPA暴露對小鼠SVF巨噬細胞比例的影響±s)

與相同飲食對照組比較：*P<0.05

圖1 各組脂肪組織染色結果 HE×400

A:ND對照組;B:10 nmol/L BPA+ND組;C:100 nmol/L BPA+ND組;D:1 000 nmol/L BPA+ND組;E:HFD對照組;F:10 nmol/L BPA+HFD組;G:100 nmol/L BPA+HFD組;H:1 000 nmol/L BPA+HFD組

圖2 免疫組化法檢測各組小鼠附睪脂肪組織IL-6表達 ×400

A:ND對照組;B:10 nmol/L BPA+ND組;C:100 nmol/L BPA+ND組; D:1 000 nmol/L BPA+ND組;E:HFD對照組;F:10 nmol/L BPA+HFD組;G:100 nmol/L BPA+HFD組;H:1 000 nmol/L BPA+HFD組

許多動物實驗和流行病學研究[2-4]都已經證明BPA可以引起肥胖。肥胖機體中常常表現出大量脂肪組織巨噬細胞的浸潤,而巨噬細胞的不斷聚集、激活，增加脂肪組織中炎癥因子的分泌，是肥胖誘導機體發生慢性低度炎癥和進一步發展為胰島素抵抗以及代謝綜合征的關鍵環節[6]。故研究BPA引起肥胖小鼠脂肪組織巨噬細胞的聚集可以為其闡明BPA誘導肥胖的發生機制提供實驗證據。

本研究結果顯示長期低劑量BPA暴露在ND小鼠和HFD小鼠中都可以引起體重和附睪脂肪墊系數的升高，且隨BPA暴露劑量的升高而上升；HE染色病理觀察顯示附睪脂肪組織中脂肪細胞形態和細胞間隙明顯增大，且存在炎性細胞浸潤，與BPA暴露劑量相關；免疫組化顯示脂肪組織炎性因子IL-6的表達在BPA組較對照組顯著升高；這些結果均表明低劑量BPA暴露在ND小鼠和HFD小鼠中，都可能引起小鼠體重增加，脂肪組織出現炎癥狀態，在HFD小鼠中尤為明顯。流式細胞術檢測附睪脂肪組織中巨噬細胞的比例顯示BPA暴露可導致脂肪組織巨噬細胞的比例明顯升高，且與BPA劑量相關，與體重和炎癥趨勢相似，表明BPA誘導肥胖中脂肪組織巨噬細胞發生明顯的聚集，且脂肪組織巨噬細胞的聚集可能在肥胖的發生發展中起著重要作用。

綜上所述，低劑量BPA長期暴露可誘導小鼠肥胖，而脂肪組織巨噬細胞的聚集可能與肥胖的發生機制相關；而BPA暴露介導脂肪組織巨噬細胞聚集的機制以及不同巨噬細胞亞型在BPA誘導肥胖中的作用是進一步研究的方向。

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Accumulation of adipose tissue macrophages in obese mice induced by bisphenol A

Li Yingpei，Luo Shimeng，Leng Yinzhi，et al

(DeptofHealthToxicology,SchoolofPublicHealth,AnhuiMedicalUniversity，Hefei230032)

Objective To investigate the accumulation of macrophages in the adipose tissue from the obese mice induced by low-dose bisphenol A (BPA) intake through potable water. Methods Four-week C57BL/6 male mice were randomly divided into normal diet (ND) group and high fat diet (HFD) group. Each group was further divided into vehicle control, 10 nmol/L BPA, 100 nmol/L BPA and 1 000 nmol/L BPA group. Mice were exposed to BPA through drinking water. After 20 weeks, mice were weighed and sacrificed. The epididymis fat pad was obtained under sterile conditions. The infiltration of inflammatory cells in adipose tissues were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. IL-6 expression in adipose tissues was detected by immunohistochemistry. The proportion of macrophages in stromal vascular fractions (SVF) was analyzed by flow cytometry. Results In ND and HFD groups, the body weight and coefficients of epididymis fat pad in BPA exposed mice were significantly increased compared with the corresponding control, and as a dose-dependent manner. The volumes of adipocytes and gap between adipocytes were exaggerated. Infiltration of inflammatory cells in adipose tissue was observed in BPA treated mice. In addition, BPA exposure upregulated IL-6 expression in adipose tissue and elevated the percentages of macrophages in SVF. Conclusion Low-dose BPA exposure can induce obesity in mice, which is associated with the accumulation of macrophages in adipose tissue.

bisphenol A; inflammation; adipose tissue macrophages

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.015.html◇預防醫學研究◇

2016-05-30接收

國家自然科學基金(編號：81473015)；安徽省自然科學基金(編號：1508085MH161)；安徽省大學生創新訓練計劃項目(編號：AH201410366103)

安徽醫科大學公共衛生學院1衛生毒理學系、2012級食品質量與安全專業、4職業衛生與環境衛生學系，合肥 23003

3安徽醫科大學第一附屬醫院臨床營養科，合肥 230022

李應配，男，碩士研究生；

沈 彤，男，博士，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail:ahmusht@163.com

R 114

A

1000-1492(2016)10-1464-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.015