樺褐孔菌抗腫瘤活性部位的篩選及化學成分研究

吳 昆，程文明,2，李春如，吳澤華，張 勛，陸維麗，李 俊

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◇藥學研究◇

樺褐孔菌抗腫瘤活性部位的篩選及化學成分研究

吳 昆1，程文明1,2，李春如3，吳澤華1，張 勛1，陸維麗1，李 俊1

目的 研究樺褐孔菌抗腫瘤活性部位及化學成分。方法 將樺褐孔菌乙醇提取物(FT)、石油醚萃取物(FA)、乙酸乙酯萃取物(FB)、正丁醇萃取物(FC)以及水層萃余物(FD)作用于人肝癌HepG2、胃癌SGC-7901及肺癌A549細胞，檢測各提取部位對腫瘤細胞的生長抑制活性，并進一步對活性部分進行化學成分研究。結果 活性數據分析表明FT、FA及FB均有抑制腫瘤活性，IC50值分別為56、28、47 mg/L。從活性部位FA及FB分離得到10個化合物，分別鑒定為羊毛甾醇(1)、3β-羥基8, 24-羊毛甾二烯-21-醛(2)、樺褐孔菌醇(3)、白樺脂醇(4)、5α, 8α-表二氧-6, 22-麥角甾二烯-3-醇(5)、4, 6, 8(14), 22-麥角甾四烯-3-酮(6)、豆甾-4-烯-3-酮(7)、Inonotsuoxides B(8)、Inonotsutriols A(9)、胡蘿卜苷(10)。結論 FA及FB是樺褐孔菌的抗腫瘤活性部位，從活性部位分離鑒定10個化合物，其中6、7、10首次在樺褐孔菌中發現。

樺褐孔菌；抗腫瘤活性；活性部位；三萜；甾醇；化學成分

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、褐臥孔菌屬(Fuscoporia)藥用真菌，主要分布在北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯、中國(東北)、日本(北海道)等國家。16～17世紀以來，東歐國家民間廣泛應用該菌防治多種癌癥(胃癌、肝癌、腸癌等)、心臟病和糖尿病[1]。研究[2-3]表明，該菌含有多糖、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、甾醇、吲哚類生物堿及酚類等成分，有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、降血壓、降血糖等藥理作用。雖然樺褐孔菌在俄羅斯民間抗腫瘤應用歷史悠久，但是其抗腫瘤藥效物質基礎尚不明確。該實驗篩選了樺褐孔菌對人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞HepG2及人肺癌細胞A549具有明顯抑制活性的部位，并對活性部位進行了化學成分分離和鑒定，為進一步探討該菌藥效物質基礎及建立質控標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥材與瘤株 樺褐孔菌產自吉林省撫松縣，2015年1月購自吉林省撫松縣御參坊特產店。由李春如教授鑒定，樣品存放在安徽醫科大學藥學院天然藥物化學實驗室。人胃癌細胞SGC-7901、人肝癌細胞HepG-2及人肺癌細胞A549由安徽醫科大學藥學院提供。

1.2 儀器與試劑 AVANCE AV400超導傅立葉變換數字化核磁共振儀(瑞士Bruker公司，內標為四甲基硅烷)；6210 TOF LC-MS液質聯用儀(美國Agilent公司)；BT253型電子天平(德國Sartorius公司)；IKA RV10 數顯型旋轉蒸發儀(德國IKA公司)；LDZX-40KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；2306-Z CO2培養箱(美國Shellab公司)；NIB-100倒置顯微鏡(浙江寧波光學股份有限公司)；uQuant全波長酶標儀(美國Biotek公司)。

柱色譜硅膠(青島海洋化工廠)；薄層色譜GF254硅膠板(煙臺江友硅膠開發有限公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(美國GE 醫療生命科學公司)；甲醇、氯仿、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯(西隴化工股份有限公司，均為分析純)；RPMI-1640培養基(美國Thermo Fisher生物制品公司)；胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；DMSO、MTT(美國Sigma公司)；PBS(武漢博士德生物科技有限公司)；胰酶(上海碧云天生物技術研究所)；5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海漢博生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 抗腫瘤活性測試 取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶消化后，用含10%滅活小牛血清的RPMI-1640完全培養液將細胞制成2×104個/ml的細胞懸液，加入96孔培養板內，每孔加180 μl，然后置于細胞培養箱內培養12 h，待細胞貼壁生長后，分別加入20 μl不同濃度5種樺褐孔菌提取物溶液(乙醇提取物-FT、石油醚萃取物-FA、乙酸乙酯萃取物-FB、正丁醇萃取物-FC和水層萃余物-FD)，使各提取物最終濃度為80、60、40、20、10 mg/ml，同時設置陰性對照組(加20 μl RPMI-1640完全培養液)，空白對照組(180 μl RPMI-1640完全培養液+20 μl生理鹽水)，陽性對照組(5-FU，劑量為50、10、2、0.4 mg/ml)，每組均設5個平行孔，細胞培養箱中培養24、48及72 h后，倒置顯微鏡下觀察藥物作用于腫瘤細胞后對其形態的影響，每孔加入20 μl 5 g/L MTT溶液，放入培養箱繼續培養4 h，棄去孔中培養液，每孔加入150 μl DMSO，恒溫振蕩器(30 ℃)上避光搖勻10 min，酶標儀492 nm測定各孔光密度(optical density,OD)值，按下列公式計算細胞生長抑制率，并計算半數抑制濃度(IC50)值[3]。

細胞生長抑制率(%) =[(陰性對照組OD值-實驗組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.3.2 提取與分離 取樺褐孔菌藥材10 kg，加10倍量的95%乙醇，60 ℃熱提取4次，每次10 h，過濾，合并藥液減壓濃縮(溫度不超過60 ℃)藥膏至無醇味，得浸膏FT 550 g。加水適量使其混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別濃縮回收萃取液，得FA 140 g、FB 220 g、FC 170 g和FD 120 g。對FA(120 g)進行反復硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、8 ∶1、7 ∶1、6 ∶1梯度洗脫，TLC跟蹤，相同流分合并，得到6個部分(FA1～FA6)，FA2經反復硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯125 ∶1、100 ∶1)純化得到化合物1(320 mg)、化合物7(30 mg)。FA3經石油醚-乙酸乙酯30 ∶1、20 ∶1、氯仿-乙酸乙酯100 ∶1、氯仿-乙酸乙酯-冰醋酸100 ∶1 ∶0.2得到化合物2(1 970 mg)。FA4 、FA5靜置析出大量白色物質，經減壓抽濾，乙酸乙酯重結晶，分別得到化合物3(570 mg)、化合物4(87 mg)。FA6靜置析出大量白色固體，減壓抽濾，經硅膠柱色譜(氯仿 ∶甲醇150 ∶1)純化得到化合物5(530 mg)；FA6減壓抽濾所得液體部分經反復硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯10 ∶1、氯仿-甲醇150 ∶1、石油醚-乙酸乙酯6 ∶1)分離得到化合物6(63 mg)。對FB(200 g)進行反復硅膠柱色譜(氯仿-甲醇100 ∶1～1 ∶1)梯度洗脫，TLC 跟蹤，相同流分合并，得到6個部分(FB1～FB6)。FB3經反復硅膠柱色譜(氯仿-甲醇150 ∶1、石油醚-乙酸乙酯6 ∶1)分離得到化合物8(47 mg)。FB4經硅膠柱色譜(氯仿-甲醇25 ∶1～1 ∶1)梯度洗脫，得到5個部分(FB4-1～FB4-5)，FB4-2經硅膠柱色譜(氯仿-甲醇60 ∶1)得到5個部分(FB4-2-1～FB4-2-5)、FB4-2-3經反復硅膠柱色譜(氯仿-甲醇100 ∶1、石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸6 ∶1 ∶0.001)純化得到化合物9(80 mg)。FB4-4經硅膠柱色譜(氯仿-甲醇1 ∶1)純化，再經反復Sephadex LH-20凝膠柱色譜(氯仿-甲醇40 ∶1、20 ∶1)分離得到化合物10(17 mg)。

1.3.3 化合物結構鑒定 通過分析波譜數據(MS，1H-NMR，13C-NMR)、檢索天然產物碳譜數據庫及查閱文獻鑒定化合物結構。

2 結果

2.1 抗腫瘤活性測試 樺褐孔菌5種提取物對3株腫瘤細胞的IC50值見表1。結果表明FT、FA、FB對3種腫瘤細胞生長有抑制作用，且呈濃度依賴關系；FC、FD不具抗腫瘤活性。

表1 5種提取物及5-FU對3株腫瘤細胞抑制作用的IC50值

2.2 結構鑒定 從活性部位FA及FB分離得到10個化合物，分別鑒定為羊毛甾醇(1)、3β-羥基8,24-羊毛甾二烯-21-醛(2)、樺褐孔菌醇(3)、白樺脂醇(4)、5α,8α-表二氧-6,22-麥角甾二烯-3-醇(5)、4,6,8(14),22-麥角甾四烯-3-酮(6)、豆甾-4-烯-3-酮(7)、Inonotsuoxides B(8)、Inonotsutriols A(9)、胡蘿卜苷(10)，其中6、7、10首次在樺褐孔菌中發現。

化合物1白色針狀結晶(丙酮)，mp.140～141 ℃，ESI-MS m/z:427.393 4[M+H]+。1H-NMR(600 MHz, CDCl3)δ:0.68(3H,s,H-28)，0.81(3H, s, H-18)，0.86(3H,s,H-30)，0.91(3H,d,J=6.1,H-21)，0.97(3H,s,H-19)，0.99(3H,s,H-29)，1.60(3H,brs, H-26)，1.68(3H, brs, H-27)，3.23(1H, dd, J=11.6 and 2.5 Hz, H-3)，5.09(1H, t, J=6.5 Hz, H-24)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據均與文獻[4]對照基本一致，故確定化合物1為羊毛甾醇。

化合物2白色針狀結晶(丙酮)，mp.145～146 ℃，ESI-MS m/z: 441.372 7[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.67(3H, s, H-18)，0.79(3H, s, H-28)，0.88(3H, s, H-30)，0.94(3H，s，H-29)，0.98(3H，s，H-19)，1.57(3H，s，H-27)，1.67(3H，s，H-26)，3.19～3.23(1H，m，J=4.5 Hz，H-3)，5.1(1H，t，J=6.9 Hz，H-24)，9.4(1H，d，J=5.1 Hz，H-21)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[4]對照基本一致，故確定化合物2為3β-羥基8, 24-羊毛甾二烯-21-醛。

化合物3白色針狀結晶(甲醇)，mp.182.1～182.7 ℃，ESI-MS m/z: 443.388 4[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.71(3H，s，H-28)，0.80(3H，s，H-18)，0.86(3H，s，H-30)，0.93(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.97(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-29) ,1.64(3H，brs，H-26)，1.74(3H，brs，H-27)，3.23(1H，dd，J=11.6 and 4.3，H-3)，3.65(1H，m，J=6.3 Hz and 3.2 Hz,H-22)，5.18(1H，t，J=6.3，H-24)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[4]對照基本一致，故確定化合物3為樺褐孔菌醇。

化合物4白色針狀結晶(氯仿-甲醇)，mp.236～238 ℃，ESI-MS m/z:443.388 3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3) δ：0.75(3H, s, CH3)，0.81(3H, s, CH3)，0.96(3H, s, CH3)，0.97(3H, s, CH3)，1.01(3H, s, CH3)，1.68(3H, s, CH3)，3.18(1H，dd，J=11.4 and 4.4 Hz，H-3)，3.33(1H，d，J=10.8 Hz，H-28a)，3.8(1H，d，J=10.8 Hz，H-28b)，4.58(1H，brs，H-29a)，4.68(1H，brs，H-29b)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[5]對照基本一致，故確定化合物4為白樺脂醇。

化合物5 白色粉末，mp.177～178 ℃，ESI-MS m/z:429.336 3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.82(3H，d，J =12.6 Hz，H-26)，0.82(3H，s，H-18)，0.83(3H，d，J=17.1 Hz，H-27)，0.88(3H，s，H-19)，0.91(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，1.00(3H，d，J =6.6 Hz，H-28)，3.97(1H，m，H-3)，5.14(1H，dd，J=15.3 and 8.2 Hz，H-23)，5.22(1H，dd，J=15.2 and 7.6 Hz，H-22)，6.24(1H，d，J=8.7 Hz，H-7)，6.51(1H，d，J =8.7 Hz，H-6)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[6]對照基本一致，故確定化合物5為5α, 8α-表二氧-6, 22-麥角甾二烯-3-醇。

化合物6淺黃色固體，mp. 114～115 ℃，ESI-MS m/z:393.315 2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3) δ：0.82(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.93(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.96(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，5.16～5.22(1H，dd，J=15.4 and 7.2 Hz，H-22)，5.22～5.28(1H，dd，J=15.2 and 7.3 Hz，H-23)，5.73(1H，s，H-4)，6.03(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)，6.6(1H，d，J=9.2 Hz，H-7)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據[7]與文獻對照基本一致，故確定化合物6為4, 6, 8(14), 22-麥角甾四烯-3-酮。

化合物7白色針狀結晶(丙酮)，mp. 95～97 ℃，ESI-MS m/z:413.177 8[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3) δ：0.71(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.4 Hz，H-27)，0.83(3H，d，J=7.6 Hz，H-26)，0.85(3H，t，J=7.2 Hz，H-29)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.18(3H，s，H-19)，5.73(3H，s，H-4)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[8]對照基本一致，故確定化合物7為豆甾-4-烯-3-酮。

化合物8無色晶體，mp. 240～242 ℃，ESI-MS m/z: 459.388 3[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.72(3H，s，H-18)，0.81(3H，s，H-29)，0.87(3H，s，H-30)，0.93(3H，d，H-21)，0.99(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-28)，1.19(3H，s，H-26)，1.21(3H，s，H-27)，3.23(1H，dd，J=12.0 and 4.5 Hz，H-3)，3.96(m，1H，J=6.8 and 4.9 Hz，H-24)，4.04(m，1H，J=9.0 and 6.8 and 3.8 Hz，H-22)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[9]對照基本一致，故確定化合物8為 Inonotsuoxides B。

化合物9無色晶體，mp. 203～205 ℃，ESI-MS m/z：459.388 1[M+H]+。1H-NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.72(3H，s，Me-18)，0.81(3H，s，Me-29)，0.91(3H，s，Me-30)，0.97(3H，s，Me-19)，1.0(3H，s，Me-28)，1.05(1H，dd，J=11.7，2.1)，1.20(3H，s，

表2 化合物1～10的碳譜數據(150 MHz，a. CDCl3 ,b.CDCl3/CH3OD)

a：化合物1～9；b：化合物10 Me-27)，1.23(3H，s，Me-26)，3.24(1H，dd，J=11.7 and 4.6)，3.72(1H，t，J=8.7 and 7.3)。13C-NMR數據及歸屬見表2。以上數據與文獻[10]對照基本一致，故確定化合物9為Inonotsutriol A。

化合物10白色粉末固體(氯仿-甲醇)，mp. 290～292 ℃，ESI-MS m/z: 577.446 3[M+H]+。13C-NMR(150 MHz，CDCl3/CH3OD)δ：104.33(C-1′)，79.02(C-2′)，80.67(C-3′)， 76.77(C-4′)，82.37(C-5′)，73.40(C-6′)， 其他碳譜數據及歸屬見表2。與胡蘿卜苷對照品共薄層，Rf值及顯色行為一致，熔點不下降，故可鑒定為胡蘿卜苷。

3 討論

從天然產物特別是大型真菌中篩選抗腫瘤活性物質一直是抗腫瘤新藥物研發的一個重要方向。樺褐孔菌作為食藥用菌，在俄羅斯民間用于抗腫瘤的歷史悠久，該菌含有多種活性成分，包括多糖、羊毛脂烷型三萜、甾醇、吲哚類生物堿及酚類等，其中三萜、生物堿通過阻滯腫瘤細胞周期、誘導細胞凋亡或分化達到抗腫瘤作用；酚類有抗氧化作用，可以抑制腫瘤細胞的生成；而多糖通過激活免疫系統抑制腫瘤細胞生長[11]。但有關樺褐孔菌抗腫瘤活性部位及活性成分的研究較少，且與活性相關的質控成分尚需進一步完善。

本實驗對樺褐孔菌各提取物進行活性篩選，發現FA的抗腫瘤活性最強，FB次之，FT較低。這與文獻[12]報道石油醚萃取物具有明顯的體內外抗腫瘤活性一致。進一步從活性部位分FA及FB分離鑒定10個三萜類和甾類化合物，初步活性篩選表明化合物1、3、5、8能抑制胃癌細胞、肺癌及肝癌細胞生長；化合物2、4、6、7對受試瘤株抑制活性較弱。據有關文獻[13-15]報道，化合物3(樺褐孔菌醇)可通過調控周期蛋白E抑制宮頸癌、卵巢癌及乳腺癌。化合物2(3β-羥基8, 24-羊毛甾二烯-21-醛)可抑制白血病細胞生長，而化合物4(白樺脂醇)抑制肺癌細胞和宮頸癌細胞活性較弱[14]。

樺褐孔菌抗腫瘤活性成分尚需進一步分離鑒定，并針對更多瘤株進行體內外活性篩選，為明確樺褐孔菌抗腫瘤藥效物質基礎，建立質控指標及探索作用機制提供科學依據。

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Screening of antitumor fractions and chemical constituents fromInonotusobliquus

Wu Kun1, Cheng Wenming1,2, Li Chunru3,et al

(1AnhuiProvincialKeyLaboratoryonBioactivityofNaturalProduct,SchoolofPharmacy,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032；2StateKeyLaboratoryofNaturalMedicines,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009;3ZhejiangBIOASIAInstituteofLifeScience,Jiaxing314200)

ObjectiveToscreentheantitumorfractionsofInonotus obliquusandtostudychemicalconstituentsfromtheactivefractions.MethodsEthanolextract(FT),petroleumetherextract(FA),ethylacetateextract(FB),n-butanolextract(FC)andaqueousextract(FD)fromInonotusobliquuswerescreenedbyinhibitingthegrowthoftumorcells(HepG2,SGC-7901,A549).Theconstituentsfromactivefractionswerefurtherisolatedandstructurallyelucidatedbyspectralanalysis.ResultsFT，FAandFBexhibitedantitumoractivity,withIC50valueofnomorethan56, 28and47mg/L,respectively.Tenknowncompoundswereelucidatedaslanosterol(1), 3β-hydroxy-lanosta-8, 24-dien-21-al(2),Inotodiol(3),betulin(4), 5α, 8α-Epidioxyergosta-6, 22-dien-3β-ol(5),ergosta-4, 6, 8(14), 22-Tetraene-3-one(6),stigmast-4-en-3-one(7),InonotsuoxidesB(8),InonotsutriolsA(9),daucosterol(10).ConlusionTwofractions,FAandFB,areantitumorfractions,fromwhich10compoundswereseparatedandelucidated.Compoud6, 7and10arereportedforthefirsttimefromInonotus obliquus.

Inonotus obliquus;antitumoractivity;activefraction;triterpenoids;steroids;chemicalconstituents

時間：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.016.html

2016-06-22接收

安徽省自然科學基金(編號：090413105)；天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室資助項目(編號：SKLNMKF201416)

1安徽醫科大學藥學院，安徽天然藥物活性研究省級重點實驗室，安徽省天然藥物活性成分工程技術研究中心，合肥 230032

2天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室(中國藥科大學)，南京 210009

3浙江泛亞生命科學研究院，嘉興 314200

吳 昆，男，碩士研究生；

程文明，女，副教授，碩士生導師，責任作者,E-mail:chengwm919@hotmail.com；

李春如，男，教授，責任作者，E-mail:chunruli@hotmail.com

R 284.2；Q 939.5

A

1000-1492(2016)10-1468-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.016