翼狀胬肉中MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達及意義

李盈龍，馬 應，王李松，蔣正軒

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翼狀胬肉中MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達及意義

李盈龍，馬 應，王李松，蔣正軒

目的 比較金屬基質蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)、新生血管因子(VEGF)在翼狀胬肉中的表達，探討3者在翼狀胬肉中的作用。方法 收集復發性翼狀胬肉患者翼狀胬肉標本38例、初發性翼狀胬肉患者翼狀胬肉標本47例和斜視患者球結膜標本32例。采用免疫組化法檢測85例翼狀胬肉和32例正常人球結膜中MMP-9、TIMP-1及VEGF的表達，比較MMP-9、TIMP-1及VEGF在3組中的表達差異，分析3者在翼狀胬肉中表達的相關性。結果 復發性翼狀胬肉和初發翼狀胬肉標本均有MMP-9、TIMP-1和VEGF的表達，MMP-9、TIMP-1和VEGF在復發翼狀胬肉和初發翼狀胬肉中陽性表達均顯著高于正常球結膜。經相關檢驗分析，在翼狀胬肉中，MMP-9和VEGF的陽性表達存在相關性；而TIMP-1與VEGF表達間無顯著相關性。結論MMP-9在翼狀胬肉發生和復發過程中發揮重要作用。其可能通過破壞細胞外基質的屏障和促進VEGF產生來調控翼狀胬肉的發生和復發。細胞外基質屏障的打破可能是翼狀胬肉發病的基礎。

細胞外基質；翼狀胬肉；復發；免疫組織化學；新生血管

翼狀胬肉是我國眼科常見病和多發病。眼球的瞼裂部球結膜和結膜下組織變性增生，并向角膜侵潤，外觀呈三角形[1]。翼狀胬肉的病因復雜，是環境因素和自身因素共同作用的結果，但其確切的發病機制至今尚不完全清楚。一致認為，在紫外線等外界因素的作用下，瞼裂區的球結膜變性及纖維血管組織大量增生，且有較強侵襲能力；同時外界的危險因素損傷了角膜緣的干細胞，使增生的組織侵入透明的角膜組織，逐漸增大覆蓋角膜[1-2]。由此可見，在翼狀胬肉發病過程中，纖維血管組織的增生和不斷的侵襲是翼狀胬肉形成的基礎，細胞間基質屏障和角膜緣屏障的破壞可能是該病進展的主要原因。

金屬基質蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)是降解細胞外基質的重要酶類，幾乎能降解細胞外基質中的全部成分。其可能通過破壞細胞外基質的降解平衡而促進病變的組織增生侵襲，突破細胞外基質的組織屏障，從而侵襲周圍的組織[3]。MMP-9是依賴金屬鋅離子的金屬酶，其底物廣泛，是當今研究熱點[4]。基質金屬蛋白酶抑制劑(matrixmetalloproteinaseinhibitor，TIMP)是MMP的抑制劑，能抑制MMP活性及其生物學功能，防止細胞外組織屏障的破壞。人體內發現4種TIMP，其中TIMP-1被廣泛研究[5]。然而，這2種蛋白酶在復發、初發翼狀胬肉中的作用及機制尚不清楚。該研究利用免疫組化法檢測復發、初發翼狀胬肉及正常球結膜組織中MMP-9、TIMP-1及新生血管的表達差異，從而闡明MMP在翼狀胬肉發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本收集 收集2012年7月～2015年2月行翼狀胬肉切除手術獲得38例復發翼狀胬肉組織、47例初發翼狀胬肉組織及32例正常人球結膜組織。3組人群年齡、性別均相互匹配。

1.2 試劑 鼠抗促血管生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)及兔抗MMP-9多克隆抗體、二步法免疫組化檢測試劑及DAB試劑盒購自北京中衫金橋公司；兔抗TIMP-1多克隆抗體購自北京生物合成技術公司。

1.3 方法

1.3.1HE染色 翼狀胬肉及正常球結膜組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規組織切片，HE染色，鏡下觀察并比較各組織的病理狀況。在同一個顯微鏡下對切片的著色顆粒進行檢測計數，比較其是否有差異。免疫組織化學方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法，即SP法。

1.3.2 免疫組化 復發、初發翼狀胬肉及正常人球結膜組織收集后，立即采用10%福爾馬林固定，然后石蠟包埋，再進行標記切片。運用二步法進行染色，步驟如下：常規脫蠟，水化組織切片，將切片放入3%過氧化氫去離子水中孵育5min(阻斷內源性過氧化物酶)，再用PBS沖洗；滴加一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，每次2min，沖洗3次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育20min，PBS沖洗，每次2min，沖洗3次；DAB顯色，再用蘇木精復染，然后封片觀察。在光學顯微鏡下進行染色參數分析，并做統計。

1.3.3 免疫組化著色顆粒的計數 在100倍顯微鏡下觀察切片中的著色細胞數，記錄每個切片中的數量。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料使用方差分析，計數資料使用χ2檢驗。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復發翼狀胬肉、初發翼狀胬肉和人類正常球結膜組織病理學變化 通過對復發、初發的翼狀胬肉和正常人球結膜的HE染色結果示：復發翼狀胬肉的表層上皮層明顯增厚，上皮細胞排列紊亂，細胞體積增大，基底上皮邊界模糊，間質中大量血管。初發翼狀胬肉的上皮細胞排列紊亂，細胞體積及細胞核增大，基底層邊界不清，間質層可見較多的血管。正常人球結膜表層上皮層較翼狀胬肉組薄，上皮細胞排列極為整齊，基底細胞邊界清晰，間質中血管較少，見圖1。

2.2 復發翼狀胬肉、初發翼狀胬肉和正常人球結膜中TIMP-1、MMP-9及VEGF的表達TIMP-1表達主要位于細胞質中，在復發胬肉、初發胬肉和正常人球結膜組織中表達陽性率約90%。在復發的翼狀胬肉組織中，TIMP-1大量表達于近基底膜的上皮細胞質中，間質的成纖維細胞也有染色。在初發翼狀胬肉中，TIMP-1陽性顆粒主要位于上皮細胞中，集中于基底膜，較復發胬肉組少。在正常球結膜組織中TIMP-1陽性表達主要位于上皮細胞，分布較為彌散，基底膜較前兩組少，見圖2。

MMP-9免疫組化結果顯示：MMP-9表達主要位于炎癥細胞和血管內皮細胞的細胞核膜上，細胞質也有染色，呈棕黃色顆粒。在復發翼狀胬肉組織中，可見大量的棕黃色顆粒。在初發翼狀胬肉組織中，基底膜下方及血管周圍均有棕黃色的顆粒著色，較復發組少。在正常球結膜組織中MMP-9僅有少量陽性表達，見圖3。

VEGF免疫組化結果顯示：呈棕黃色的顆粒，位于間質層、上皮層和血管壁上。在復發翼狀胬肉組織中，可見大量的棕黃色顆粒位于復發翼狀胬肉間質層中，上皮層中均有表達。在初發翼狀胬肉組織中，間質層有VEGF棕黃色的顆粒物表達，上皮層中有表達。在正常球結膜組織中上皮層有表達，間質層中表達很少，見圖4。

圖1 復發、初發翼狀胬肉和正常球結膜組織 HE×400

圖2 人正常球結膜與翼狀胬肉中TIMP-1的表達 免疫組化×400

圖3 人正常球結膜與翼狀胬肉中MMP-9的表達 免疫組化×200

圖4 人正常球結膜與翼狀胬肉中VEGF的表達 免疫組化×400

顯微鏡下相同倍率的視野下著色顆粒的計數見表1。結果表明TIMP-1、MMP-9和VEGF在復發翼狀胬肉和初發翼狀胬肉組織明顯高于正常球結膜組織；進一步分析，其在復發翼狀胬肉組織的表達明顯高于初發翼狀胬肉組織。

表1 TIMP-1、MMP-9和VEGF在復發、初發翼狀胬肉和正常球結膜表達著色顆粒計數比較±s)

2.3MMP-9、TIMP-1表達與VEGF在翼狀胬肉中的表達的相關性 在38例復發翼狀胬肉和47例初發翼狀胬肉中MMP-9、TIMP-1和VEGF蛋白陽性表達分別是69、73和57例。MMP-9和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達關系見表2。TIMP-1和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達關系見表3。經χ2檢驗后，VEGF與MMP-9蛋白表達相關(χ2=6.91，P=0.013);VEGF與TIMP-1蛋白表達相關(χ2=0.09，P=0.623)。

表2 MMP-9和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達關系(n)

表3 TIMP-1和VEGF蛋白在翼狀胬肉中的表達關系(n)

3 討論

翼狀胬肉是眼科一種常見的眼表疾病，常表現為鼻側球結膜組織增厚的病變。其通過破壞角膜前彈力層和角膜的基質層，造成視覺質量的下降和外觀缺陷。目前臨床上對翼狀胬肉的主要治療方式是翼狀胬肉切除術，但患者術后復發率較高[4]。關于翼狀胬肉的發病機制，研究[2]表明細胞外基質和角膜緣干細胞屏障的破壞是翼狀胬肉進展的基礎。當翼狀胬肉組織中的細胞外基質等屏障受到破壞，胬肉組織進展迅速，侵入角膜組織。MMP-9是基質金屬蛋白家族的重要成員之一，主要功能是降解和重塑細胞外基質[3,5]。在正常的組織中，一方面，MMP-9通過分解和重塑，實現細胞外基質的重建，同時其還能調控其他蛋白酶、細胞因子及炎癥介質的活性；另一方面，MMP-9刺激血管內皮細胞及成纖維細胞分泌VEGF來調控新生血管的發生。TIMP是MMP的天然抑制劑，阻止MMPs酶原活化，抑制已活化的MMPs酶的活性。TIMP-1是多功能分子，不僅能抑制MMPs酶的活性，還能刺激皮質類固醇的生成、抑制血管發生、改變細胞形態學作用[5]。研究[5-7]表明，新生血管在翼狀胬肉中發揮重要作用，翼狀胬肉中存在大量VEGF及新生血管的表達，這一結果證實了新生血管的發生是翼狀胬肉形成的重要機制。其中角膜成纖維細胞產生的VEGF能夠促進局部組織毛細血管網的形成，被認為是新生血管生成的最重要的生長因子之一[7]。鑒于MMP-9和TIMP-1在維持細胞外基質動態平衡和新生血管生成等方面的作用，以及這兩個因素在翼狀胬肉的發生的重要作用[8]，本實驗通過研究MMP-9、TIMP-1和VEGF在翼狀胬肉發病中的作用，并進一步分析其內在關系。

本研究隨機收集手術后的復發翼狀胬肉、初發翼狀胬肉及正常球結膜組織標本。HE染色結果顯示，復發翼狀胬肉組織上皮層明顯最厚，細胞體積增大，上皮細胞排列紊亂，上皮基底部呈不規則樣改變，間質中新生血管數量明顯增加；初發翼狀胬肉次之。結果表明球結膜組織細胞的增殖和侵襲性生長是翼狀胬肉發展的重要原因?？赡芘c細胞外基質屏障的破壞緊密相連[3]。本研究通過檢測翼狀胬肉組織中MMP-9和TIMP-1的表達情況來評價細胞外基質的動態平衡，結果顯示MMP-9和TIMP-1在翼狀胬肉組織中表達明顯高于正常球結膜，且在復發翼狀胬肉中表達最高。研究[9-10]表明，MMP-9在翼狀胬肉中表達增高，這一結果與本研究的結果一致。結果表明，MMP-9參與了翼狀胬肉的發生及復發。然而，與本研究結果不同是，TIMP-1被報道在翼狀胬肉中表達無明顯增加[5,11]。結果的差異可能有以下原因：首先，術前患者接受的治療可能不同；其次，標本的收集、處理以及患者的年齡不完全相同，導致結果的不同；再次，胬肉標本收取時疾病所處時間不相同會造成結果的差異[7]。當外界因素刺激翼狀胬肉組織，MMP-9表達增加，TIMP-1也相應地增加來維持細胞外基質的平衡；隨著疾病的進展，MMP-9表達進一步增加，細胞外基質平衡打破，翼狀胬肉組織侵襲性增加，導致翼狀胬肉的快速生長和復發[11]。本實驗進一步分析MMP-9和TIMP-1與VEGF的關系，顯示MMP-9與VEGF相關，而TIMP-1與VEGF無相關性。這一結果提示，MMP-9可能通過破壞細胞外基質和促進VEGF的產生這兩個方面引起翼狀胬肉的發生和復發。

翼狀胬肉是結膜及其結膜下組織的增殖性病變，尤其結膜下組織增生明顯，本研究僅觀察結膜組織MMP-9和TIMP-1與VEGF分子的表達，具有一定片面性，在以后的研究中，需進一步完善。盡管如此，本實驗表明MMP-9在翼狀胬肉發生和復發過程中發揮重要作用，其可能通過破壞細胞外基質的屏障和促進VEGF的產生來調控翼狀胬肉的發生和復發，這一結果將為治療人類翼狀胬肉這一眼表常見疾病提供新的理論依據。

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Expression and significance of vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinase 9 and matrix metalloproteinaseinhibitor1inthepterygium

LiYinglong,MaYing,WangLisong，etal

(Dept of Ophthamology, The Thind Affiliated Hospital of Anhui Medical University,The First People’s Hospital of Hefei, Hefei 230061)

ObjectiveToinvestigatetheexpressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),matrixmetalloproteinase9 (MMP-9)andmatrixmetalloproteinaseinhibitor1 (TIMP-1)inpterygiumandfindtherolesoftheminthisdisease.MethodsThirty-eightrecurrentpterygium,forty-sevenearlyonsetpterygiumandthirty-twonormalbulbarconjunctivaswereobtainedinpresentstudy.TheexpressionsofMMP-9,TIMP-1andVEGFweretestedin85casesofpterygiumand32casesofnormalconjunctivalbyusingimmunehistochemicalmethod.TheexpressionsoftheMMP-9,TIMP-1andVEGFwerecomparedinthethreegroupsofpatientsandtherelationsamongthemwereanalyzed.ResultsTheMMP-9,TIMP-1andVEGFwereexpressedintherecurrentpterygiumandearlypterygiumspecimens.ThepositiveratesofMMP-9,TIMP-1andVEGFsignificantlyincreasedintherecurrentandearlypterygiumpterygiumsamplescomparedwiththenormalconjunctivasamples.Inpterygium,therewasarelationbetweenexpressionMMP-9andVEGFcorrelationexists,buttherewasnocorrelationbetweenTIMP-1andVEGFbyusingtheχ2analysis.ConclusionMMP-9playsanimportantroleinthepathogenosisofoccurrenceandrecurrencepterygium.ItmaydestroytheextracellularmatrixbarriersandpromoteVEGFproductiontocontroltheoccurrenceandrecurrenceofpterygium.Breakingdowntheextracellularmatrixbarriersmaybethebasisinhumanpterygiumpathogenesis.

extracellularmatrix;pterygia;recurrent;immunohistochemical;neovascularisation

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.021.html

2016-07-21接收

安徽省高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2013A147)

安徽醫科大學第三附屬醫院、合肥市第一人民醫院眼科，合肥 230061

李盈龍，男，碩士，副主任醫師，責任作者，E-mail:Lylong3760@sohu.com

R382.33

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.021