TPD52在膠質瘤中的表達水平及臨床意義

高兵兵，秦 浩,秦家振,孫移坤,張昊駒,劉 晨，侯江雷，黃佛寶，羅 丹，戴宜武

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TPD52在膠質瘤中的表達水平及臨床意義

高兵兵1，秦 浩1,秦家振2,孫移坤2,張昊駒1,劉 晨2，侯江雷2，黃佛寶2，羅 丹2，戴宜武1

目的 探究TPD52在膠質瘤及正常腦組織中的表達及其臨床意義。方法 收集46例膠質瘤患者病例標本及瘤旁正常腦組織，應用熒光定量PCR、Western blot、免疫組織化學染色方法檢測TPD52 mRNA、蛋白的表達量，并分析臨床指標與TPD52表達量之間的關系。結果 熒光定量PCR及Western blot結果具有一致性，均提示TPD52的表達量隨膠質瘤病理分級升高，Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤TPD52表達量明顯高于正常腦組織、Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。免疫組織化學染色顯示TPD52蛋白定位在膠質瘤細胞質中，67.4%病理標本高表達TPD52(或)。結論 TPD52 mRNA與蛋白在膠質瘤細胞中高表達，其蛋白表達量與膠質瘤病理分級呈正相關性，與生存期呈負相關性，其可能是膠質瘤臨床治療的一個潛在基因靶點。

膠質瘤；TPD52；病理分級；生存期

腦膠質瘤是發(fā)病率最高的顱內惡性腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的一半[1]，平均生存期僅為9～12個月[2]。雖然臨床上“手術+放療+化療”[3]為主的綜合治療發(fā)揮到極致，但由于膠質瘤的浸潤性、放療的低敏感性、血腦屏障對化療藥物的阻隔性，患者預后仍未明顯改善。因此，研究者把目光轉向基因治療，經(jīng)過多年的探索，基因治療有望成為人類戰(zhàn)勝腫瘤的手段之一，而靶基因的篩選是基因治療的核心。TPD52是近年來發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其位于8q12染色體上，由200余個氨基酸組成[4]。TPD52基因被發(fā)現(xiàn)已有二十年，但對其作用的研究仍剛剛起步。目前為止，TPD52在膠質瘤的作用仍未被報道。該研究通過檢測TPD52在原發(fā)惡性膠質瘤以及瘤旁正常腦組織中的表達水平，分析其在膠質瘤中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 膠質瘤標本來源于2007年1月～2012年1月北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院膠質瘤患者46例，其中男20例，女26例；年齡37～75(62.3±3.2)歲。按照WHO病理分級標準，經(jīng)術后病理證實，其中Ⅰ級4例，Ⅱ級15例，Ⅲ級14例，Ⅳ級13例。隨訪時間為3年。病例納入標準：① 患者均為原發(fā)膠質瘤且第一次行膠質瘤全切術；② 術后行規(guī)范化放療加替莫唑胺化療；③ 患者無其他惡性腫瘤、全身系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病。病例排除標準：① 患者術后復發(fā)，再次手術；② 非正常死亡患者。

1.2 實驗材料與試劑 一抗：人TPD52抗體購自英國Abcom公司(ab132140)；BCA蛋白分析試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京天根生物有限公司)；引物由生工生物(北京)工程有限公司合成。

1.3 免疫組化 膠質瘤標本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，PBS沖洗3遍，3% H2O2阻斷，PBS再次沖洗3遍，抗原修復，山羊血清封閉，加一抗(1 ∶1 000稀釋)后4 ℃過夜，PBS沖洗3遍，滴加二抗后37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3遍，加SP后37 ℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復染、脫水、透明、封片。通過陽性細胞染色率與染色濃度方式評估TPD52蛋白表達量。陽性細胞染色率得分：0(<5%,陰性)，1(5%～25%，弱陽性)，2(25%～50%，陽性)，3(>50%，強陽性)。細胞染色濃度得分：0(未染色)，1(淡黃色)，2(棕黃色)，3(棕褐色)。免疫組化最終得分等于陽性細胞染色率×細胞染色濃度，為0～9分。TPD52表達水平分為：-(0～1分)，+(2～3分)，(4～6分)，(7～9分)。病理樣本分為：TPD52低表達組(TPD52-或TPD52+)，TPD52高表達組(TPD52或TPD52)。

1.4 TPD52 mRNA提取、逆轉錄與熒光定量PCR 取約60 g凍存腦組織研磨成粉，總RNA的提取采用TRIzol法，分光光度計測量總RNA在260/280下的濃度及純度。然后，取1 μg總RNA，行逆轉率得到cDNA。最后將cDNA適當稀釋后行熒光定量PCR擴增評估TPD52表達水平，以β-actin作為內參基因。反應體系20 μl，包括2 μl cDNA、2×SYBR Premix Ex TaqⅡ、0.4 μl 50×ROX Reference Dye、各0.8 μl上下游引物、6 μl無菌離子水。循環(huán)參數(shù)設置如下：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，總共40個循環(huán)。引物序列如下：TPD52 上游引物:5′-TTCACAGGCAGGACAGAAAGA-3′,下游引物:5′-TTGAAGGTCGCAGAGTTCCT-3′;β-actin上游引物：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′,下游引物:5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。采用2-ΔΔCt方法分析結果。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達量 從液氮中取出冰凍的組織標本，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。8% SDS-PAGE膠電泳分離含25 μg的蛋白樣品，將分離后的蛋白轉移到PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗TPD52(1 ∶1 000)、GAPHD(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜，TBST洗PVDF膜3遍，加二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，再次TBSA洗PVDF膜3遍，顯色。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5軟件進行分析，組間、組內比較采用t檢驗，TPD52蛋白表達量與患者年齡、性別的關系采用Spearman法分析，TPD52蛋白表達量與患者生存期的關系采用Kaplan-Meier方法。

2 結果

2.1 TPD52 mRNA在膠質瘤和正常腦組織中的表達水平 由于執(zhí)行PCR擴增需要約60 g組織提取總mRNA，部分病理標本體積較小，無法從瘤旁正常腦組織提取足夠的總mRNA，因此，選擇其中35例來執(zhí)行熒光定量PCR分析。經(jīng)過對數(shù)據(jù)結果進行Ct值計算分析，瘤旁正常腦組織、膠質瘤組織ΔCt值分別為5.02±0.34、1.14±0.20，采用配對t檢驗方法，結果顯示與瘤旁正常腦組織比較，TPD52 mRNA表達量在膠質瘤細胞中顯著增高(P<0.01)。而且TPD52 mRNA表達量隨膠質瘤病理分級升高而升高(圖1)，Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ的ΔCt值分別為1.45±0.31、0.73±0.47，在Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤中的表達量明顯高于Ⅰ、Ⅱ級，表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 TPD52 mRNA在不同級別膠質瘤與瘤旁正常腦組織中的表達量

A：瘤旁正常腦組織；B：Ⅰ級膠質瘤；C：Ⅱ級膠質瘤；D：Ⅲ級膠質瘤；E：Ⅳ級膠質瘤

2.2 免疫組化結果 通過免疫組織化學染色顯示在膠質瘤標本中TPD52蛋白主要定位在細胞質中。在不同級別的膠質瘤中TPD52蛋白表達均為陽性，其中31例(67.4%)高表達TPD52(或)，其余15例低表達TPD52(-或+),而瘤旁正常腦組織中僅5例低表達TPD52(-或+)，表達陽性率為10.8%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TPD52蛋白隨膠質瘤病理分級升高而增高，Ⅰ級膠質瘤與Ⅱ級膠質瘤、Ⅲ級膠質瘤與Ⅳ級膠質瘤TPD52 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤中TPD52蛋白的表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ膠質瘤中，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3 Western blot法檢測蛋白量結果 TPD52蛋白表達量與TPD52 mRNA表達量具有一致性。與瘤旁正常腦組織比較，膠質瘤明顯高表達TPD52蛋白(圖3)。TPD52蛋白表達量隨膠質瘤級別升高而增加。在Ⅳ級膠質瘤中表達量最高，Western blot條帶灰度值最高，在正常腦組織中表達量最低，Western blot條帶灰度值最低,TPD52蛋白在瘤旁正常腦組織、Ⅰ～Ⅱ膠質瘤、Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤中表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 TPD52 蛋白在不同級別膠質瘤中的表達量 免疫組化×200

圖3 TPD52蛋白在4組配對膠質瘤與瘤旁正常腦組織中的表達

A：瘤旁正常腦組織；B：Ⅰ級膠質瘤；C：Ⅱ級膠質瘤；D：Ⅲ級膠質瘤；E：Ⅳ級膠質瘤

2.4 TPD52表達量與臨床指標的關系 經(jīng)對患者年齡、性別、WHO病理分級、生存期臨床指標與TPD52蛋白表達量進行統(tǒng)計分析(表3)，結果顯示年齡、性別與TPD52蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義，而病理分級與TPD52蛋白表達量呈正相關性，生存期與TPD52蛋白表達量呈負相關性，高表達TPD52蛋白患者(中位生存期11.74個月)比低表達TPD52蛋白患者(中位生存期23.32個月)生存期短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

表3 膠質瘤中TPD52表達量與臨床指標的關系(n)

3 討論

腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展是涉及多種基因相互作用的復雜過程，包括一系列突變基因的積累、原癌基因的激活、抑癌基因的失活。因此，基因治療成為人類戰(zhàn)勝腫瘤的手段之一，而靶基因的篩選是基因治療的核心。

圖4 TPD52表達量與患者生存期的關系

TPD52是一種原癌基因，由200余個氨基酸編碼，位于8q12染色體上，這段區(qū)域在多種腫瘤中頻繁擴增，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。TPD52被首先報道在乳腺癌[5]中過度表達。后續(xù)研究[6]顯示TPD52在肺癌、前列腺癌、卵巢癌、B細胞淋巴瘤等惡性腫瘤中表達增高。

Chen et al[7]發(fā)現(xiàn)肺癌組織比正常肺組織中的TPD52表達增高，Lewis et al[8]進一步發(fā)現(xiàn)TPD52促進肺癌細胞的轉化及轉移。Wang et al[9]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中TPD52表達量升高，前列腺癌病理分級越高其表達量越高，且預示著差的術后生存期。Byrne et al[10]發(fā)現(xiàn)TPD52在卵巢癌中表達量同樣升高，且與患者生存期呈負相關性。Ummanni et al[11]報道TPD52在乳腺癌中的高表達與不良的預后有關，且促進乳腺癌細胞的擴增、侵襲。以上這些研究結果，說明TPD52是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展一種生物標志物，可能是基因治療的靶點。研究[7,9,11]表明TPD52在多種腫瘤組織中表達升高，與腫瘤分級、預后密切相關，參與腫瘤發(fā)生、擴增、浸潤及轉移等進程。Yang et al[12]敲除乳腺癌中TPD52基因后，發(fā)現(xiàn)這可以抑制乳腺癌細胞的增殖及集落形成，使細胞周期停留在G0/G1期，促進GSK3β磷酸化作用。Mirshahidi et al[13]經(jīng)過對TPD52基因研究，對乳腺癌小鼠模型采取TPD52基因治療后，可明顯延長模型鼠生存期。進一步證實了TPD52在惡性腫瘤治療中擁有廣泛的前景。

目前國際上關于TPD52在腫瘤中的表達水平、臨床意義及相關機制的報道仍很少，國內暫無此有關報道。本研究數(shù)據(jù)首次證實TPD52在膠質瘤組織中過度表達，瘤旁正常腦組織中不表達或少量表達，統(tǒng)計分析證實TPD52表達量與患者術后生存期呈負相關性。同時，本研究數(shù)據(jù)表明TPD52的表達量隨病理分級升高而升高，這表明TPD52具有促進膠質瘤發(fā)生發(fā)展的作用。因此，TPD52可能是膠質瘤分化程度及術后生存期的分子生物學指標。

綜上所述，推測TPD52對膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的影響和促進作用，可能是反應膠質瘤惡性程度和預后的標志物，這提示TPD52是膠質瘤臨床治療的一個潛在基因靶點，為在膠質瘤治療的研究中提供了新的思路和基因靶點。由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種基因相互的結果，TPD52在膠質瘤中具體機制尚不清楚，需要更深入的研究進行闡明。

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Expression level of TPD52 in gliomas and its clinical significance

Gao Bingbing1,Qin Hao1,Qin Jiazhen2，et al

(1AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,AnhuiMedicalUniversity,Beijing100000；2AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100000)

ObiectiveToexploretheexpressionoftumorproteinD52(TPD52 )inhumangliomaandnormalbraintisseanditsclinicalsignificance.MethodsCollectingspecimensof46casesofgliomasandnormalbraintissueadjacenttotumours.TheexpressionofTPD52wasinvestigatedbyreal-timequantitativePCR,Westernblotandimmunohistochemistryingliomas.TherelationshipsbetwenTPD52espressionandclinicalfactorswereanalyzed.ResultsTheresultsofreal-timequantitativePCRandWesternblotshowedthattheexpressionofTPD52mRNAandproteinsignificantlyincreasedingliomatissuesascomparedwiththoseinnormalbraintissues．Immunohistochemistrydisplayedthat67.4%gliomatissuesexpressedhigherTPD52protein.ConclusionTheexpressionsofTPD52mRNAandproteinaresignificantlyhigheringliomathannormalbraintisse,andtheexpressionofTPD52proteinispositivelyassociatedwithgliomaWHOclassificationandnegativelyassociatedwithpatientslifetime.Itmaybeapotentialtargetgenestotreatgliomas.

glioma;TPD52;pathologicalgrade;lifetime

時間：2016-8-10 11:04:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.028.html

2016-05-19接收

國家自然科學基金(編號：81271391)

1安徽醫(yī)科大學北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院，北京 100000

2北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一醫(yī)院腦科醫(yī)院，北京 100000

高兵兵，男，碩士研究生；

戴宜武，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：dddyyywww@163.com

R 730.26

A

1000-1492(2016)10-1521-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.028