核苷類似物替比夫定對免疫抑制小鼠細胞免疫功能的調節作用

顧宇峰 黃莉莉 孫偉 宗雪萍 譚曉慧 湯偉

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核苷類似物替比夫定對免疫抑制小鼠細胞免疫功能的調節作用

顧宇峰 黃莉莉 孫偉 宗雪萍 譚曉慧 湯偉

目的 觀察替比夫定對小鼠細胞免疫功能的調節作用。方法 BALB/C小鼠48只，隨機分為3組：正常對照組、替比夫定組和環磷酰胺模型組。正常對照組與環磷酰胺模型組小鼠給予生理鹽水(0.2 mL/只)灌胃，替比夫定組小鼠給予替比夫定(86.5 mg/kg)灌胃，每日1次，共35 d。自第29天起，環磷酰胺模型組、替比夫定組小鼠給予環磷酰胺(30 mg/kg)腹腔注射，每日1次，連續7 d。末次給藥后第2天，處死所有小鼠并取標本待檢。小鼠骨髓單個核細胞以GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)培養7 d以誘導樹突狀細胞(DC)。DC細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達采用流式細胞儀檢測。DCs與C57BL/6鼠T淋巴細胞混合培養4 d后，采用MTT比色法檢測淋巴細胞增殖狀況。小鼠血清中IL-4、IFN-γ濃度采用ELISA檢測。結果 替比夫定組小鼠DC細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達水平明顯高于環磷酰胺模型組(PMHC-Ⅱ<0.05，PCD40<0.01)。DCs與脾T淋巴細胞混合例為1∶10、1∶20，替比夫定組小鼠DCs刺激淋巴細胞增殖能力均高于環磷酰胺模型組(P1∶10<0.01，P1∶20<0.05)。替比夫定組小鼠血清中IFN-γ的濃度高于環磷酰胺模型組(PIFN-γ<0.05)，但兩組的血清IL-4水平差異無統計學意義(PIL-4>0.05)。結論 替比夫定對細胞免疫功能具有一定的增強作用。

替比夫定；樹突狀細胞；IFN-γ；IL-4；慢性乙型肝炎

慢性乙型肝炎治療的最基礎和關鍵措施是有效地抑制體內的HBV復制乃至清除HBV，其已成為共識。核苷(酸)類似物由于具有抑制病毒復制速度較快、服用方便、副作用較少及治療費用相對較低等優點而成為慢性乙型肝炎抗病毒治療的最主要的選擇。但患者長期服用此類藥物后停藥仍常有復發，如為HBeAg陽性患者治療后未能實現HBeAg血清轉換而停藥則復發率更高。替比夫定的一些臨床研究結果顯示，持續接受替比夫定治療2年、3年、4年后患者的HBeAg血清轉換率分別為32%、46%、53.2%，且經該藥治療獲得滿意應答的患者停藥60周和204周后的累積復發率僅為16.3%和23.3%[1-2]。為探究該藥良好療效的機制，一些學者進行了基礎和臨床研究。多位學者觀察到以替比夫定治療的慢性乙型肝炎患者可出現外周血調節性T細胞比例降低、樹突狀細胞成熟度改善及Th1類細胞因子水平升高等變化[3-5]；另有學者報道，替比夫定可在體外促進感染3型鼠肝炎病毒小鼠巨噬細胞的TNF-α、IL-12 mRNA轉錄和細胞因子分泌[6]；本研究組曾觀察到替比夫定可提高環磷酰胺所致免疫抑制小鼠T、B淋巴細胞的增殖能力[7]。為進一步驗證替比夫定是否具有免疫調節作用，本研究采用環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠模型，觀察其對小鼠細胞免疫的影響。

資料和方法

一、材料與儀器

BALB/C小鼠(SPF級) 48只，雌性，體重(20±2) g，4～5周齡；C57BL/6小鼠(SPF級) 8只，雌性，體重(20±2) g，4～5周齡；均由南通大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SC×K(蘇)2008-0010，使用許可證號：SC×K(蘇)2007-0021。 環磷酰胺：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號：10051821)。替比夫定：北京諾華制藥有限公司生產(批號：x0243)。四甲基偶氮唑鹽(MTT)：購自美國Sigma公司。重組鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組鼠白細胞介素-4(rmIL-4)：均購自美國PEPROTECH公司。 藻紅蛋白(PE)標記抗小鼠MHC-Ⅱ類分子抗體、CD40抗體：美國Biolegend公司。 IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒：上海依科塞生物制品有限公司。ELX800通用酶標儀(美國BioTek公司)、流式細胞儀(美國BECTON DICKINSON公司)。

二、方法

(一)動物分組與處理 48只小鼠隨機分為正常對照組、環磷酰胺模型組與替比夫定組，每組16只。正常對照組與環磷酰胺模型組小鼠給予生理鹽水(0.2 mL/只)灌胃，替比夫定組小鼠給予替比夫定溶液(86.5 mg/kg體重，0.2 mL/只)灌胃，每日1次，共35 d；自第29日起在灌胃后，環磷酰胺模型組、替比夫定組小鼠給予環磷酰胺30 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續7 d，以制備小鼠免疫抑制模型[8]。于末次給藥后第2天，對各實驗小鼠以摘眼球法取血，分離血清，-80℃冰箱保存。

(二)小鼠骨髓來源樹突狀細胞(DC)的誘導與培養 處死小鼠后取股骨，用RPMI1640培養液沖洗骨髓腔，收集沖洗液體，去除紅細胞，用完全培養液重懸細胞(2×106個/mL)，分置于12孔培養板內，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2、100%濕度下培養；24 h后全量換液，每孔加入GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL)，繼續培養至第8天，收集懸浮細胞(即為DCs)。

(三)DC表面分子檢測 收集培養至第8天的DC，PBS洗滌后重懸(5×105/mL)；將DC細胞懸液加入流式管中，各流式管中分別加入MHC-Ⅱ-PE抗體、CD40-PE抗體，4℃避光孵育30 min；PBS洗滌后重懸；以流式細胞儀進行檢測細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達。

(四)混合淋巴細胞反應 收集培養至第8天的各組DCs，用PBS洗滌后以完全培養液重懸(5×105個/mL)。取C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死后取脾，常規方法制備脾細胞懸液，加入淋巴細胞分離液中，離心后吸取單個核細胞層，PBS洗滌后以完全培養液重懸(10×106/mL)。實驗于96孔培養板中進行，每例設3個復孔：實驗孔加入DCs和脾T淋巴細胞(DCs/T的比值分別為1∶10、1∶20)，對照孔僅加入脾T淋巴細胞；37℃、5% CO2、孵育4 d。每孔加入20 μL MTT，再孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜100 μL/孔，10 min后用酶標儀以570 nm波長測各孔OD值并計算各孔的DC刺激指數(SI)：

SI=實驗孔OD值÷對照孔OD值

(五)小鼠血清中IL-4、IFN-γ濃度的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，操作按試劑盒說明書進行。反應結束后于10分鐘內用酶標儀以450 nm波長測各孔OD值。根據IL-4、IFN-γ標準品的濃度和相應OD值，求出IL-4、IFN-γ濃度回歸方程分別為：y=-52.593x2+519.99x-9.3818(IL-4)；y=30.633x2+406.22x+9.7033(IFN-γ)。將各小鼠血清標本的OD值分別代入回歸方程計算出該標本的細胞因子濃度。

三、統計學分析

結 果

一、替比夫定對小鼠DC細胞表面分子表達的影響

收集培養第8天的DC，以流式細胞儀分析。3組小鼠DC細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達水平均有明顯差異(F(MHC-Ⅱ)=13.04，P<0.01；F(CD40)=21.21，P<0.01)：正常對照組DC細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達均高于環磷酰胺模型組和替比夫定組；替比夫定組小鼠DC細胞表面分子MHC-Ⅱ、CD40的表達均高于環磷酰胺模型組；詳見表1。 圖1為各組DC細胞表面分子的流式檢測圖。

二、替比夫定對DC體外刺激T淋巴細胞增殖能力的影響

3組小鼠DC刺激淋巴細胞增殖能力(DC刺激指數 SI)有明顯差異(F(1∶10)=52.10，P<0.01；F(1∶20)=27.11，P<0.01)：正常組小鼠DC刺激淋巴細胞增殖能力高于替比夫定組和環磷酰胺模型組；替比夫定組小鼠DCs刺激淋巴細胞增殖能力高于環磷酰胺模型組；詳見表2。

三、替比夫定對小鼠血清中細胞因子IFN-γ、IL-4水平的影響

3組小鼠的血清中IFN-γ和IL-4濃度均有明顯差異(F(IFN-γ)=15.12，P<0.01；F(IL-4)=12.52，P<0.01)：正常對照組小鼠血清中IFN-γ的濃度高于替比夫定組和環磷酰胺模型組小鼠，替比夫定組小鼠血

圖1 各組DC細胞表面分子流式檢測結果圖

組別例數MHC-ⅡCD40正常對照組868.358±5.73357.388±5.837替比夫定組859.564±5.653a49.470±4.746a環磷酰胺模型組852.606±7.059bc36.673±8.189bd

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，dP< 0.01，與替比夫定組比較

表2 各組小鼠DC刺激脾淋巴細胞增殖能力(±s)

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，dP<0.01，與替比夫定組比較

表3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-4濃度(pg/mL，±s)

注：aP<0.05，bP<0.01，與正常對照組比較；cP<0.05，與替比夫定組比較

清中IFN-γ的濃度高于環磷酰胺模型組；與正常對照組比較，替比夫定組和環磷酰胺模型組小鼠血清中IL-4的濃度均較低，且差異均有統計學意義，但這兩組之間的差異無統計學意義；詳見表3。

討 論

CHB的發病機制尚未完全闡明，但一致認為與病毒因素及宿主免疫功能密切相關。機體的免疫系統中參與清除HBV的機制包括細胞免疫和體液免疫，其中細胞免疫正常與否決定HBV感染機體后轉歸的最重要因素。大量研究資料發現，慢性乙型肝炎患者存在免疫功能缺陷，不能有效清除體內HBV而導致病毒持續感染[10]。

抗原提呈細胞(APC)具有捕捉處理抗原、并將抗原提呈給淋巴細胞，使后者活化、增殖并發揮免疫應答效應的重要功能。體內的DC按其發育分化程度可分為成熟DC和未成熟DC，二者的生物學特征有明顯差異。成熟DC高表達MHC-Ⅱ類分子和CD40、CD80等，體外激發MLR能力和抗原提呈能力強。有研究發現，與正常人比較，CHB患者外周血DC細胞表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子等的表達不足，刺激T細胞增殖、自體CTL細胞毒作用的能力均明顯降低，可能是CHB患者抗HBV特異性應答不足的重要原因之一[11]。本項研究中，觀察到替比夫定治療組小鼠DC細胞的MHC-Ⅱ和CD40等表面分子表達水平和刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力均明顯高于環磷酰胺模型組，提示該藥不僅能夠促進DC細胞的發育和分化，提高體內成熟DC水平，而且能夠改善DC細胞刺激T細胞活化增殖的功能。

CD4+Th細胞是調節免疫應答的一類重要調節性細胞, CD4+T 細胞分為Thl 和Th2 兩個亞群。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，參與細胞毒性T 細胞(CTL) 介導的細胞免疫；Th2細胞的主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，通過這些細胞因子下調Th1細胞的免疫調節作用。目前認為宿主免疫調控紊亂尤其是Th1/Th2反應失衡可能是導致HBV持續感染和慢性乙型肝炎的重要原因之一。曾氏等[12]研究發現：急性乙型肝炎患者相比，慢性乙型肝炎患者血清中的IL-2和IFN-γ水平明顯降低而IL-4水平明顯升高。 本實驗中觀察到，替比夫定組小鼠血清的Th1型細胞因子IFN-γ的含量明顯高于環磷酰胺模型組，而Th2型細胞因子IL-4的血清水平在兩組之間差異無統計學意義，此結果與王煜、朱斌等[3-4]的臨床觀察結果相似，提示替比夫定主要提高Th1細胞的免疫反應能力。

近年來發現，NK細胞不僅具有重要的抗病毒和抗腫瘤作用，還能夠通過抗原呈遞、分泌細胞因子及細胞直接接觸等方式發揮免疫調節作用[13]。有研究者觀察到，慢性HBV感染者外周血中NK細胞數較正常人明顯減少，患者血清中HBV DNA水平與NK細胞水平成負相關，提示NK細胞的減少可能與HBV感染的慢性化有關[14]。在本課題組關于替比夫定免疫調節作用的前期實驗研究中，觀察到替比夫定治療的小鼠的NK細胞殺傷活性明顯高于環磷酰胺模型組[7]，與吳氏[14]的臨床研究結果相似，提示替比夫定對NK細胞的活性有一定的增強作用。

綜上所述，替比夫定能夠有效改善環磷酰胺所致免疫抑制小鼠細胞免疫功能，表明該藥對機體的細胞免疫功能具有一定的增強作用。此可能是接受替比夫定治療慢性乙型肝炎患者發生HBeAg血清轉換率較高以及獲得滿意療效后停藥后復發率較低的重要原因。

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(本文編輯：易玲)

江蘇省高校自然科學研究面上項目(11KJB10008)

226001 江蘇 南通大學附屬醫院感染性疾病科(顧宇峰，黃莉莉，宗雪萍，譚曉慧，湯偉)；南通大學醫學院病原生物系(孫偉)

湯偉，Email：tdfy16302@163.com

2016-05-11)