腫瘤環境下脂肪間充質干細胞旁分泌因子促進結腸癌細胞侵襲

陳冬梅，劉淑丹，馬會明，劉曉明，梁雪云，魏 軍

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腫瘤環境下脂肪間充質干細胞旁分泌因子促進結腸癌細胞侵襲

陳冬梅1，劉淑丹1，馬會明2，劉曉明1，梁雪云1，魏 軍1

目的 確定腫瘤環境下人類脂肪間充質干細胞(hAMSCs)的旁分泌特征變化與腫瘤細胞侵襲的關系。方法 體外分離培養AMSCs,收集培養上清液制備條件培養基，用于培養HCT116細胞。利用Transwell培養板共培養AMSCs與HCT116細胞。通過檢測穿透人工基底膠(Matrigel膠)的能力比較兩種培養條件下HCT116細胞侵襲能力的差異。實時熒光定量PCR檢測HCT116細胞上皮間質轉化(EMT)相關基因的表達變化。ELISA法檢測共培養后AMSCs基因表達和旁分泌因子表達變化。結果 結腸癌細胞系HCT116與AMSCs的Transwell共培養系統中，HCT116細胞的侵襲能力較AMSCs條件培養液培養顯著增強。同時結腸癌細胞系HCT116構成的腫瘤微環境也影響了AMSCs旁分泌因子表達的變化，其中成纖維生長因子10(FGF10)、血管內皮生長因子C(VEGFC)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素10(IL-10)的表達較正常培養條件下顯著上調。結論 腫瘤微環境影響下的AMSCs旁分泌因子表達改變，這些變化能夠增強結腸腫瘤細胞的侵襲能力。

轉移性；旁分泌因子；脂肪間充質干細胞；結腸癌

肥胖已成為發達國家和部分發展中國家共同面對的人口健康問題。肥胖與腫瘤的關系發生在機體的各個方面，在肥胖群體中，腫瘤的發生和不良預后均高于正常體重指數的群體[1]。有研究[2]顯示腫瘤周圍的脂肪間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs)較骨髓間充質干細胞更易遷徙至腫瘤組織中，并伴隨間充質細胞內皮化，說明AMSCs作為重要的肥胖相關的腫瘤微環境細胞可能在促進腫瘤細胞增殖和遷移中起了重要作用。同時AMSCs在提供腫瘤生長和血管形成方面的作用已被肯定，但是其對腫瘤細胞上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是否有關鍵影響卻報道很少[3]。腫瘤細胞的EMT是腫瘤發生遠端轉移的必然進程。因此闡明AMSCs在特定腫瘤微環境下對腫瘤細胞遷移的作用機制是重要的理論創新，對相關疾病的防治有重要的指導意義。該研究選取HCT116結腸癌細胞系與原代分離的AMSCs共培養，觀察HCT116結腸癌細胞系的轉移特性和AMSCs的旁分泌改變，從而闡明AMSCs影響HCT116結腸癌細胞系發生EMT的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人脂肪組織來源于寧夏醫科大學總醫院行腹部外科手術的非腫瘤患者，經醫院倫理學委員會批準且獲得患者知情同意。結腸癌細胞系HCT116由寧夏醫科大學總醫院人類干細胞研究所實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清(FBS)、DMEM ∶F12(1 ∶1)、胰蛋白酶、TRIzol(Invitrogen公司)； A型膠原酶(Roche公司)；反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒(Fermentas公司)；山羊抗人多克隆抗體E-cadherin、vimentin (Santa Cruz 公司)；CY3標記兔抗山羊二抗 (博士德公司)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；CO2培養箱(Thermo公司)；定量PCR儀、電泳儀 (Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 手術無菌條件下取脂肪組織，無菌運輸至實驗室。立即剔除系膜和血管組織，剪碎后置于1 g/L 膠原酶A中37 ℃消化1 h，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液和未消化漂浮組織，紅細胞裂解液(155 mmol/L NH4Cl, 20 mmol/L Tris pH 7.6)裂解紅細胞，1000 r/min 離心5 min，重懸于含15%FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養基中，以3.2×104個細胞/cm2密度接種于100 mm培養皿中，次日換液去除未貼壁細胞，37 ℃、5%CO2繼續培養6 d，待細胞匯合至80%，即可傳代，期間每2 d換液1次。HCT116細胞培養于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養基中。

1.2.2 條件培養基的制備 1×106個AMSCs培養24 h收集培養上清液，0.45 μm濾膜過濾，作為條件培養基繼續用于培養HCT116細胞。

1.2.3 共培養系統 利用膜孔徑為0.4 μm 的Transwell小室進行兩種細胞共培養，下室接種AMSCs，上室接種HCT116，共培養于含10% FBS的DMEM ∶F12(1 ∶1)培養基中，共培養10 d，期間正常換液和傳代，10 d后取出AMSCs，重新接種于無血清和添加因子培養基中培養24 h，收集上清液用于ELISA檢測成纖維生長因子10(fibroblast growth factor 10, FGF10)、血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)的表達。HCT116細胞用做免疫組化、侵襲實驗等。

1.2.4 ELISA檢測 正常培養或與腫瘤細胞共培養后的AMSCs消化離心后，以4×105個細胞的密度重新接種于60 mm皿，無血清培養24 h，收集上清液用于ELISA檢測，分別標記為對照組和共培養組。

1.2.5 細胞RNA提取及實時定量PCR 檢測 收集正常培養、AMSCs條件培養基培養和與AMSCs共培養后的HCT116細胞，分別標記為對照組、條件培養基組和共培養組。TRIzol提取各試驗組樣本總RNA后，紫外分光光度計和電泳檢測RNA濃度、純度和完整性。通過隨機引物體外逆轉錄獲取cDNA，用SYBR Green染料法獲得不同樣本中目的基因的相對表達量。通過2-ΔΔCt算法，計算統計分析目的基因mRNA相對內參GAPDH基因表達水平的差異。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 免疫熒光染色 各處理組細胞經4%多聚甲醛固定，0.3%TritonX-100細胞膜穿孔10 min，根據二抗來源選擇山羊或兔血清封閉30 min，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)一抗(1 ∶100) 4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，Cy-3或FITC熒光標記二抗室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次，DAPI染核3 min，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞特異性發光情況。

1.2.7 流式分析 流式細胞儀檢測第3代AMSCs表面標志物CD105、CD90、CD73、CD34的表達，流式細胞術檢測由BD FACSCaliburTMplatform完成。

1.2.8 成脂和成骨分化 分化培養基參考已發表文獻[4]，成脂分化21 d后油紅O染色，成骨分化21 d后茜素紅染色。

1.2.9 腫瘤細胞侵襲實驗 12 mm Transwell小室膜表面(8 μm孔隙大小)包被1 ∶5稀釋的Matrigel基底膜基質40 μl，小室至于37 ℃孵化4～5 h形成凝膠。5×104個HCT116細胞重懸于200 μl 0.5%血清培養基中，接種至有凝膠的上室，500 μl 10%FBS的培養基補充至下室中。培養24 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色光學顯微鏡下確定細胞遷移到基底膜背面的細胞數量。

2 結果

2.1 AMSCs的培養和鑒定 原代接種2 d后，AMSCs貼壁，生長出短臂，7 d后布滿100 mm培養皿，傳代培養后，細胞呈典型間質細胞樣，梭形，漩渦樣生長(圖1A)。成脂誘導分化后能分化出油紅O染色陽性的脂肪樣細胞(圖1B)，成骨誘導分化后能分化出茜素紅著色的鈣沉積顆粒(圖1C)。流式細胞術檢測該細胞中間充質干細胞表面標志物CD73、CD105、CD90陽性細胞占總細胞的90%以上，不表達造血干細胞標志物CD34(圖1D)。

2.2 共培養后結腸腫瘤細胞系HCT116的形態和特征變化 正常培養的HCT116細胞呈上皮樣、團簇樣生長(圖2A1)，表達上皮細胞標志物E-cadherin(圖2B1)。與AMSCs共培養10 d后HCT116細胞發生間質樣改變，伸展出短臂，游走至團簇之外(圖2A2)，開始表達間質細胞標志物Vimentin蛋白(圖2B2)。

2.3 共培養后HCT116細胞EMT相關基因表達變化 熒光定量PCR檢測EMT相關基因ZEB1、Slug、Snail、Twist和E-cadherin的表達，結果顯示與AMSCs共培養后的HCT116細胞中，間質相關基因ZEB1、Slug、Snail、Twist的表達上調，差異有統計學意義(FZEB1=87.762，FSlug=17.187，FSnail=83.332，FTwist=94.513，P<0.01)，而上皮標志基因E-cadherin表達下降，差異有統計學意義(FE-cadherin=135.060，P<0.05)。同時，通過AMSCs條件培養基進行的非接觸性的培養發現，HCT116細胞中EMT相關基因Slug、E-cadherin表達較正常培養條件下無明顯差異， ZEB1、Snail、Twist的表達上調(P<0.05)。見圖3。

圖1 AMSCs培養及特征鑒定

A：P1代AMSCs形態 ×40；B：成脂分化后油紅O染色 ×100；C：成骨分化后茜素紅染色 ×100；D：流式細胞術檢測表面標志物

圖2 共培養后HCT116細胞表型變化

A1：正常HCT116細胞形態 ×40；B1：E-cadherin ×200；C1：DAPI ×200；A2：共培養后HCT116細胞形態 ×40；B2：Vimentin ×200； C2：DAPI ×200

2.4 共培養后HCT116細胞侵襲性的改變 結果顯示兩種細胞共培養后，穿透Matrigel膠包被的Transwell基底膜的HCT116細胞數量顯著高于正常培養和條件培養組，差異有統計學意義(F=279.377，P<0.001)。見圖4。2.5 共培養后AMSCs旁分泌因子的變化 Transwell共培養與條件培養基培養后，HCT116細胞在遷移和侵襲能力上的差異，說明腫瘤微環境下的AMSCs的旁分泌因子組成發生了變化，導致HCT116細胞侵襲能力增加。進一步檢測共培養后AMSCs的旁分泌因子的表達，結果顯示：經過與腫瘤細胞共培養后，AMSCs分泌的FGF10、TNF-α、VEGFC和IL-10的表達顯著高于正常培養條件下的分泌量(FFGF10=44.169，FTNF-α=10.915，FVEGFC=207.644，FIL-10=133.698，P<0.01)。見圖5。

圖3 HCT116細胞EMT相關基因表達變化

圖4 共培養后HCT116細胞侵襲能力變化

圖5 與腫瘤細胞共培養后AMSCs所分泌細胞因子變化

3 討論

通常條件下，EMT在胚胎發育中發揮重要作用，同樣在原始腫瘤的侵襲和遷移中EMT也普遍被認為起了關鍵作用。這一過程中上皮樣腫瘤細胞頂-底極性消失，蛋白水解活性升高，侵襲細胞外基質的能力增高。頂-底極性是細胞中蛋白和脂質結構非均勻分布造成的，能抑制細胞的運動，以及細胞與其所處環境的交流。在EMT過程中，細胞丟失E-鈣黏蛋白、緊密連接蛋白和細胞角蛋白等上皮標志基因，表現出N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白等間質樣表型[5]。實驗證明，腫瘤微環境中的信號分子通過復雜的信號網絡控制EMT，如表皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、Wnt1、TGF-β和IL-6通過激活酪氨酸激酶受體(RTKs)、Wnt、TGF-β、NF-κB等信號通路，激活一組下游的轉錄調控因子：Snail、Slug、Twist 和ZEB1等[6-7]，可以誘導EMT和浸潤性癌癥的形成。獲得間質表型的腫瘤干細胞亞群是腫瘤轉移和復發的關鍵因素。本研究檢測發現HCT116細胞與AMSCs共培養后獲得了Snail、Slug、Twist 和ZEB1等基因的表達上調，E-cadherin上皮標志基因表達下降，并表達Vimentin蛋白，說明AMSCs促進了HCT116細胞的EMT發生。而AMSCs條件培養基培養的HCT116細胞在以上各間質標志基因的表達較共培養組低，說明腫瘤微環境造成了AMSCs旁分泌因子的改變。

腫瘤的微環境包括低氧、酸性、細胞外分泌因子等很多因素組成[8]。已有研究[9]顯示，在結腸癌中，由環境中的肌成纖維細胞分泌的肝細胞生長因子(HGF)促進腫瘤細胞EMT和腫瘤起始能力，并伴隨腫瘤細胞中Wnt通路高度激活。間充質干細胞(MSCs)能夠在化療中被激活，并分泌許多生長因子，包括：VEGF、EGF、IGF-1和HGF等；趨化因子SDF-1/CXCR4以及炎癥細胞因子IL-6和TNF-α等，通過PI3K/AKT、Wnt和STAT3等信號通路保護腫瘤細胞免受化療藥物的損傷，并引發腫瘤細胞的EMT和干細胞特性[10]。這些研究證明腫瘤中的間充質干細胞通過細胞間通信對腫瘤細胞本身增殖、遷徙和侵略特性的影響。而對腫瘤微環境中的間充質干細胞本身特征改變的研究還非常少。本試驗選取的HCT116結腸癌細胞系是含有β-catenin突變的細胞系，該細胞系表達包括Wnt1、Wnt3a等數種Wnt配體，能通過自分泌和旁分泌途徑模擬體內環境下結腸癌腫瘤微環境[11]。來源于腹部手術廢棄脂肪組織中分離的AMSCs，在與HCT116結腸癌細胞系共培養后，表達更高的生長因子IGF、FGF10、VEGFC，進一步ELISA檢測結果顯示腫瘤環境下的AMSCs表達更高的VEGFC、FGF10、TNF-α和IL-10，有報道[12]顯示其中VEGFC是典型的促血管生成細胞因子，IL-10可能和腫瘤細胞的免疫豁免和逃逸有關[13]，而FGF10和TNF-α是與EMT直接相關的細胞因子[14-15]，其高表達證明腫瘤微環境下AMSCs更能夠促進腫瘤細胞的生長和侵襲。AMSCs與腫瘤細胞之間的這種正反饋聯系可能是通過細胞因子的旁分泌途徑實現的，其中的具體機制還需要進一步研究。本研究闡明了腫瘤微環境下AMSCs旁分泌因子表達譜的改變影響了結腸腫瘤細胞的侵襲能力，研究細胞與微環境之間的關系將為更好地明確腫瘤發展的機制提供實驗依據，對肥胖相關腫瘤臨床診療提供理論指導。

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Chen Dongmei1，Liu Shudan1，Ma Huiming2，et al

Paracrine factors from adipose-mesenchymal stem cells enhance metastatic capacity of colon-cancer cell in tumor microenvironment

(1Human Stem Cell Institute of General Hospital，2Key Laboratory of Fertility Preservation andMaintenanceofMinistryofEducation,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004)

Objective To investigate the underpinning mechanisms by which human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) promote cancer metastasis remain elusive. Methods Colon cancer cells were co-cultured with AMSCs using a Transwell model. The capacity of invasion of HCT116 cells in the indicated conditions was detected by a Transwell invasive assay. The transcripts of EMT-associated genes in HCT116 treated with indicated conditions were determined by a qRT-PCR assay. Concentration of indicated paracrine factors and cytokines of the culture medium was ascertained by an ELISA. Results The results showed that AMSCs could promote colon cancer cells to a mesenchymal-like phenotype in a contact-dependent manner. Reciprocally, colon cancer cells were able to induce AMSCs to produce metastasis-related factors and cytokines, such as fibroblast growth factor 10 (FGF10), vascular endothelial growth factor C (VEGFC)，tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin 10 (IL-10) in part through a mechanism of an activation of tumor microenvironment. Intriguingly, an inhibition of contact with AMSCs led a reduced capacity of invasion of colon cancer cellsinvitro. Conclusion These findings thus suggest that the crosstalk between the microenvironment of cancer cells and paracrine factors of AMSCs has an implication in colon cancer malignancy. This study thus uncovers a novel paracrine factors mediated-crosstalk between colon cancer cells and AMSCs in colon cancer malignancy.

metastatic; paracrine factor; adipose mesenchymal stem cells; colon cancer

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.018.html

寧夏自然科學基金(編號NZ13162)

1寧夏醫科大學總醫院干細胞研究所，銀川 750004

2寧夏醫科大學教育部生育力保持重點實驗室，銀川 750004

陳冬梅，女，博士，助理研究員；

魏 軍，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：Lydiajunwei@163.com

R 73-37

A

1000-1492(2016)01-0036-06

2015-09-30接收