Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對兔股骨頭壞死修復的實驗研究

石正松,李 強,寧寅寬,蔡偉良,李詩鵬

?

Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對兔股骨頭壞死修復的實驗研究

石正松,李 強,寧寅寬,蔡偉良,李詩鵬

目的 應用聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、電鏡掃描(SEM)和X射線能譜分析技術(EDS)評價腺病毒-骨形態發生蛋白-2/骨髓間充質干細胞/脫鈣松質骨(Ad-BMP-2/BMSCs/DBM)對兔股骨頭壞死的治療效果，為臨床治療股骨頭壞死探索新途徑。方法 ① 采用髓芯減壓聯合液氮冰凍法制備兔股骨頭壞死模型；② 將造模成功的兔子隨機均等分為A、B、C、D組(n=12)，A組不植入材料，為造模組，B、C、D分別植入DBM、DBM/BMSCs、BMP-2/BMSCs/DBM；③ 術后4、8、12 周各組分別處死4只兔子，運用RT-PCR、SEM、EDS檢測股骨頭BMP-2表達量、表面形貌和鈣磷比(Ca/P)，觀察股骨頭的修復情況。結果 RT-PCR結果顯示各時間點BMP-2表達量A組

股骨頭壞死；骨髓間充質干細胞；骨形態發生蛋白2；RT-PCR；電鏡掃描；能譜分析

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)確切病因不明，目前公認的致病因素有13種[1]，是在不同病因下股骨頭血液供應障礙,引起軟骨下骨變性、壞死,繼而造成股骨頭塌陷,最終引發髖關節退行性、破壞性改變的一種疾病。有文獻[2]表明ONFH已經替代了髖關節結核，躍居髖關節疾病首位[3]，并且ONFH有了年輕化趨勢。目前對于ONFH的治療方法有多種，例如中醫療法、體外微波沖擊治療、髓芯減壓[4]、髖關節置換等[5]，但是這些均不是理想而合理的治療方法，探尋更為有效的治療手段勢在必行。骨組織工程的發展在治療ONFH方面展現了良好的前景，并逐漸成為研究熱點。種子細胞、支架材料、細胞調控因子是骨組織工程學的3個基本要素。但是究竟采用何種種子細胞最好，選取哪種支架材料為宜，如何解決細胞調控因子持續表達的問題，國內外尚無定論[6]。該實驗通過腺病毒介導人骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)轉染骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復合脫鈣松質骨(demineralized bone matrix，DBM)的方式構建組織工程骨,將其植入兔ONFH模型,旨在探討其對ONFH的修復能力,為將來骨組織工程的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織工程骨(hBMP-2/BMSCs/DBM) 本課題組經過前期研究，已利用腺病毒介導hBMP-2轉染BMSCs復合DBM的方式成功構建了組織工程骨[7]。

1.1.2 實驗動物 新西蘭大白兔48只，雌雄不拘，約3.2 kg，清潔級，購于桂林醫學院實驗動物中心，對動物的處理符合倫理學精神。

1.1.3 主要試劑和器材 水合氯醛(天津大茂化學試劑廠)；凝膠海綿(江西祥恩醫療科技發展有限公司)；注射用青霉素鈉(華北制藥公司)；總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；M-MLV First Strand Kit試劑盒(上海滬峰生物科技有限公司)；DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；2×Taq Mastermix(大連寶生物工程有限公司)；多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；場發射掃描電鏡(荷蘭Philips公司)；X射線能譜分析儀(英國Oxford公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 實驗動物均右側參與實驗，參照李海冰 等[8]髓芯減壓術聯合液氮冰凍的操作步驟，實驗動物取俯臥位，10%水合氯醛水溶液耳緣靜脈注射(3 ml/kg)麻醉。由臀大肌與闊筋膜張肌的間隙進入，暴露臀小肌及髓關節外旋肌群，并貼骨面將其切斷，暴露關節囊以后小十字口切開，外旋股骨頭，使股骨頭暴露而不使其脫位，在骨與軟骨的交界處用直徑為3.5 mm的無菌鉆頭，向股骨頭方向打孔，深度為4 mm，用小刮匙刮除股骨頭內骨質，造成約50%的缺損，然后用液氮持續冷凍股骨頭，約5 min。

1.2.2 實驗分組并植入材料 動物術畢后行影像學檢測，確認造模成功后隨機分為A、B、C、D 組，每組12只。A組為造模組，不做處理，復溫后立即逐層關閉切口；B、C、D組動物在造模復溫后沿向鉆孔內分別填塞體積為3 mm×3 mm×3 mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，醫用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關閉切口；術后各組動物臀大肌注射青霉素鈉預防感染(每只兔40萬U/d，連續3 d)。

1.2.3 RT-PCR法檢測骨股頭BMP-2基因表達 4、8、12 周各組分別處死4只兔子，取出股骨，清除表面組織，沿基底部將股骨頭鋸掉后矢狀剖開，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5 ml EP管,按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟操作，并通過凝膠電泳行質量檢測，使用分光光度計進行純度濃度測定，計算出RT-PCR反應體系(20 μl體系)中所需1 μg RNA所需的體積量。使用PCR儀與M-MLV First Strand Kit試劑盒合成cDNA。根據BMP-2的基因序列利用primer 5.0合成引物，FP:5′-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA -3′，RP：5′-GCATCTGTTCGGAAAACCT-3′；GAFDH的FP:5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，RP：5′-G TGGTTCACACCCATCACAA-3′,然后使用PCR儀與2×Taq PCR MasterMix試劑盒進行PCR擴增，94 ℃ 2 min，(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×30個循環，72 ℃ 2 min。擴增完畢后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物(U：140 V；I:175 mA；T：30 min)，凝膠圖像分析系統拍照并分析其表達量,以目的/內參來分析各組的基因表達情況。

1.2.4 微觀形貌觀察與能譜分析 取4、8、12 周的4組標本和一塊正常兔股骨頭標本，每個標本剖面隨機挖取3塊1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30 min，共3次；4%多聚甲醛固定15 min；25%、50%、75%、95%、100%乙醇溶液各脫水15 min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta 200 FEG場發射環境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer，EDS)測定微區主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復3次，然后計算鈣磷比(Ca/P)。

2 結果

2.1 BMP-2表達情況 凝膠成像分析系統顯示：DNA Marker大小為100～600 bp，GAPDH大小為221 bp，目的條帶(BMP-2)大小為180 bp。各組標本在各時間點均有BMP-2基因的表達，見圖1。凝膠成像系統輝度分析顯示：術后4 、8 、12周，A、B、C、D組內BMP-2表達量依次遞增；術后各時間點A、B、C、D組之間的BMP-2表達量為A組

表1 各時間點各組BMP-2基因表達量(目的/內參，

2.2 SEM與EDS 電鏡下正常骨組織板層結構致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯，未見骨板斷裂、扭曲等現象，見圖2a。4周時，A組骨板裂痕仍然清晰，出現纖維增生；8周時見骨小梁變細，部分斷裂，纖維增生較前增加，欠規則，未見鈣化顆粒；12周時見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無明顯新生成骨表現，見圖2b。B、C兩組在4 ～8周時可見骨小梁變細，但未出現大量斷裂現象，骨小梁表面出現“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現鈣化顆粒沉積；12周時可見纖維表面鈣化顆粒進一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態欠佳，新生骨板結構不整，仍不成熟，如圖2c、2d。D組在4周時出現大量新生膠原纖維，形態規則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現低鈣化類骨質；8周時鈣化物電子密度進一步增大，低密度類骨質逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細胞漸豐富；12周時新生骨繼續改建，新生骨板致密、規則，骨小梁結構趨向正常，并出現規則的骨陷窩及骨細胞，與正常骨組織形態大致相同，見圖2e。

正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P=2.06，見圖3a。A組在4 ～12 周的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，見圖3b。B、C兩組在4 周時鈣磷含量較低；8 周時Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12 周時Ca、P元素含量進一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩定狀態，Ca含量超過了P元素，B組Ca/P=1.33,C組Ca/P=1.52，見圖3c、3d。D組在4 周時即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8 周時Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達到2.85；12 周時Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩定，Ca/P=1.99，與正常骨組織含量及Ca/P無較大差異，見圖3e。

圖1 PCR檢測各組的BMP-2基因表達

圖2 12周SEM觀察 ×10 000

A：正常骨股骨頭組織；b:A組;c:B組;d:C組;e:D組

圖3 12周能譜分析

A：正常骨股骨頭組織；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

3 討論

研究[9]表明，BMSCs有多向分化能力、免疫原性小、增殖能力強、來源充足、取材廣泛等優點，目前在組織工程和臨床上已經廣泛使用。BMP有誘導成骨作用，其中BMP-2成骨誘導作用最強，是最有前途的骨誘導物質[10]；DBM具備良好的黏附率和孔隙率，利于種子細胞的黏附和生存，并且其取材于正常骨組織，有良好的生物組織相容性，是比較理想的生物支架材料[11-12]。本研究根據基因工程和組織工程原理采用腺病毒介導hBMP-2轉染兔BMSCs復合DBM的方法體外構建組織工程骨，然后將該組織工程骨植入兔ONFH模型中進行觀察研究以評估Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對ONFH的效果。

RT-PCR技術可以在短時間內擴增出足量的DNA以供研究，有特異性高、敏感性高、易自動化等優點，是組織工程中重要的檢測手段[13]。PCR和凝膠成像系統顯示4～8周 A組BMP-2均有微弱表達，提示其有微弱修復作用，12周時BMP-2表達量較前降低，可能為修復停止，骨小梁壞死、吸收所致。B、C、D組在各時間點BMP-2均有大量表達，且D組表達量遠大于B、C兩組，提示DBM、BMSCs/DBM、hBMP-2/BMSCs/DBM對股骨頭壞死都有修復作用，但hBMP-2/BMSCs/DBM對股骨頭壞死的修復作用明顯優于DBM、BMSCs/DBM組。

SEM利用電子束在樣品上逐點逐行掃描，直接觀察其表面形貌，是一種理想的超微結構表面特征分析手段[14]。經過電鏡掃描成像可見A組結構混亂，已經看不到完整骨小梁結構及骨細胞，B、C兩組鏡下可見骨小梁及低分化類骨質，D組可見大量規則骨小梁、細胞豐富，與正常骨組織類似，提示D組修復效果明顯大于前3組。

體內骨生成包括成骨細胞分化增殖,骨基質分泌,鈣鹽沉積和骨組織結構改建成熟等過程。EDS 是一種以一定能量的加速粒子轟擊待分析樣品，從樣品中激發出特征射線，以顯示出活體組織的形態學影像及相應的元素分布圖，從而確定樣品中各元素的種類和含量的方法，成為顯微分析不可缺少的一部分[15]。EDS顯示4～12周 A組Ca、P元素含量較低，且沒有任何變化，可能為ONFH吸收后沒有得到修復；B、C兩組4～12周 Ca、P含量有一定變化，且較A組有所增高，但Ca、P含量和Ca/P始終低于D組，提示兩組股骨頭均有不同程度的骨修復；D組Ca、P含量經過降低、快速增加、緩慢增加、趨于穩定的過程，Ca/P經過降低、激增、回復正常的過程。Ca、P元素及Ca/P的變化提示D組股骨頭經過了成骨分化過程，得到了良好修復。

本研究結果提示：在黏附率、孔隙率及相容性合適的支架上，hBMP-2基因等細胞因子高效持續表達，不斷地誘導BMSCs向骨細胞分化，促使組織工程骨修復壞死的股骨頭區域，進而達到臨床治愈ONFH的目的。本研究通過組織工程方法在成骨方面已經取得一定成效，但是在成骨的同時亦發現其成血管能力較弱，如何在成骨的同時增加血管的再生能力仍然是一個值得探索和研究的內容。

綜上所述，hBMP-2/BMSCs/DBM對ONFH有明顯的修復作用，且其修復效果遠遠優于DBM和BMSCs/DBM。BMSCs在BMP-2的誘導下可以持續向骨細胞分化，產生新生骨組織，填充壞死區域，防止股骨頭塌陷，對早期ONFH的治療有良好的應用前景，為臨床治療ONFH提供了新的思路和方法，值得進一步探討和研究。

[1] Kim S Y, Kim T H.Genetic Studies in osteonecrosis of the femoral head[M]//Osteonecrosis. Springer Berlin Heidelberg, 2014: 61-9.

[2] Coll R, Aguirre M, Hernandez A, et al.Mesenchymal stromal cells for osteonecrosis of the femoral head (ONFH). data from ongoin clinica trial[J]. Cytotherapy, 2014, 16(4): S97-8.

[3] Chamberlain J R,Schwarze U,Wang P R,et al.Gene targeting in stem cells from individuals with osteogenesis imperfecta[J].Science,2004,303(5661):1198-201.

[4] Wang C J, Huang C C, Wang J W, et al. Long-term results of extracorporeal shockwave therapy and core decompression in osteonecrosis of the femoral head with eight-to nine-year follow-up[J]. Biomed J, 2012, 35(6): 481-5.

[5] Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-7.

[6] Bose S, Roy M, Bandyopadhyay A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds[J]. Trends Biotechnol, 2012, 30(10): 546-54.

[7] 陳佳濱, 李 強, 茹 嘉, 等. 腺病毒介導 BMP-2 和 EGFP 基因轉染兔骨髓基質干細胞及種植脫鈣骨的體外觀察[J].中國骨質疏松雜志, 2014, 20(8):869-74.

[8] 李海冰, 瞿向陽, 李 明, 等. 應用軟骨下鉆孔結合液氮冷凍制作兔股骨頭缺損壞死模型[J]. 第三軍醫大學學報, 2014,36(19):23.

[9] Lebouvier A, Poignard A, Cavet M, et al. Development of a simple procedure for the treatment of femoral head osteonecrosis with intra-osseous injection of bone marrow mesenchymal stromal cells: study of their biodistribution in the early time points after injection[J]. Stem Cell Res Ther, 2015, 6:68.

[10] Sekiya I, Larson B L, Vuoristo J T, et al. Adipogenic differentiation of human adult stem cells from bone marrow stroma (MSCs)[J]. J Bone Miner Res, 2004, 19(2): 256-64.

[11] 李 強,唐際存,王銳英,等.完全脫鈣松質骨的生物學特性(英文)[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,47:14.

[12] 李 強,孫正義,嚴冬雪,等.脫鈣骨基質材料的生物學表現:降解性能、孔隙率及其黏附性能特征[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(31):6121-4.

[13] 程 谷,李祖兵. 骨組織工程中的檢測方法及其效果評估展望[J]. 國際口腔醫學雜志, 2010, 37(5): 593-6.

[14] Melling M,Karimian·Teherani D,Mosfler S,et al.3-D morphological characterization of the liver parenehyma by atomic force microscopy and by scanning electron micmacopy[J].Microsc Res Tech,2004,64(1):1-9

[15] 顏 彥, 周海靜, 聶紅兵.醫學領域中骨組織元素分析方法[J].口腔生物醫學, 2012, 3(1): 41-4.

Experimental study on the repair of Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis

Shi Zhengsong,Li Qiang,Ning Yinkuan,et al

(Dept of Emergency Traumatic Surgery,The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001)

Objective To evaluate the effect of the Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis by the RT-PCR, SEM and EDSand explore the new treatments for femoral head necrosis.Methods ① Prepare femoral head necrosis models by clinical core decompression combined with liquid nitrogen frozen.② After building models,animals were randomly divided into 4 groups(n=12) as follows:group A was not implanted anything as control group,group B was implanted into DBM,group C was implanted into hBMP-2/DBM,group D was implanted into hBMP-2/BMSCs/DBM.③ Four rabbits of each group were killed at 4,8,12 weeks after surgery to evaluate the reparation of ONFH through the RT-PCR,SEM and EDS. Results The RT-PCR showed: the expression of BMP-2 in group A

osteonecrosis of femoral head;bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein -2;RT-PCR;SEM;EDS

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.028.html

國家自然科學基金(編號：31160199)；廣西自然科學基金(編號：2014jjAA40064)

桂林醫學院附屬醫院急診創傷外科，桂林 541001

石正松，男，碩士研究生；

李 強，男，主任醫師，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：li.q12251970@163.com

R 687.34

A

1000-1492(2016)01-0059-05

2015-09-30接收