黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株HepG2增殖抑制作用

武 超，許杜娟,2，楊 翠，夏 泉,2，張醫浩

?

黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株HepG2增殖抑制作用

武 超1，許杜娟1,2，楊 翠1，夏 泉1,2，張醫浩1

目的 探討黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株(HepG2)增殖抑制作用及其可能機制。方法 采用MTT方法檢測5-氟尿嘧啶單獨或聯合黃芪皂苷Ⅱ作用于細胞后，5-氟尿嘧啶對HepG2的抑制率；Hoechst33342染色檢測細胞凋亡；Western blot檢測絲裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK)以及凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、活化凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved PARP)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)的表達。結果 MTT法結果顯示，5-氟尿嘧啶呈濃度和時間依賴性抑制肝癌HepG2細胞增殖，聯用黃芪皂苷Ⅱ可以顯著增加5-氟尿嘧啶對HepG2細胞增殖抑制作用(P<0.05)；Western blot法結果顯示，聯合使用黃芪皂苷Ⅱ和5-氟尿嘧啶能增加Cleaved PARP表達(P<0.05)；Hoechst33342驗證聯合用藥組較5-氟尿嘧啶組細胞凋亡水平升高；此外，Western blot結果還顯示，黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白表達； 聯用ERK1/2特異性抑制劑PD98059明顯增加5-氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡率以及凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表達(P<0.05)。阻斷ERK1/2后，黃芪皂苷Ⅱ促進5-氟尿嘧啶誘導的凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9表達以及細胞凋亡水平并未明顯增加。結論 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株HepG2增殖抑制作用，其機制可能與抑制p-ERK1/2的表達有關。

黃芪皂苷Ⅱ；5-氟尿嘧啶；HepG2；細胞凋亡

肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率占我國惡性腫瘤的第2位，每年約有22萬人死于原發性肝癌[1]。5-氟尿嘧啶常用于治療胃腸道惡性腫瘤，其對腫瘤抑制率降低是制約其療效的重要原因。黃芪作為傳統中草藥，有補氣升陽、利尿托毒、排膿生肌等功效[2]。研究[3]顯示黃芪提取物有抗腫瘤活性，黃芪注射液、黃芪精口服液等藥物已被廣泛應用于臨床參與聯合抗腫瘤治療[4]，但其具體抗腫瘤活性成分及機制仍不清楚。黃芪皂苷Ⅱ為黃芪皂苷的主要成分[5]，是否能有效聯合抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶抑制肝癌細胞株HepG2增殖、增加其療效目前尚未見報道。該研究旨在探討黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株HepG2增殖抑制作用及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、藥品與試劑 人肝癌細胞株HepG2(中國科學院上海生命科學院)；DMEM高糖培養基(美國Hyclone生物技術有限公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)；黃芪皂苷Ⅱ(南京澤朗有限公司，純度98%)；5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司)；Hoechst33342、甲基偶氮唑藍(MTT)、ERK1/2特異性抑制劑PD98059(美國Sigma公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗、β-actin 抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；絲裂原活化蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK1/2)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cleaved caspase 3)、活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-9(Cleaved caspase 9)、凋亡蛋白多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抗體(美國Cell Signaling公司)。

1.2 檢測指標和方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞株HepG2采用10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 g/L鏈霉素的高糖DMEM培養基置于37 ℃、5%的CO2培養箱中貼壁生長，取對數期生長的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞活力 取對數生長期HepG2細胞株，0.25%胰酶消化后用DMEM培養基制成單細胞懸液，以5×103個/孔細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后吸棄上清液，加入預定藥物培養；每組設5個復孔，每孔加入200 μl含藥培養基。培養預定時間后，加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續在培養箱中培養4 h，吸棄上清液后每孔加入150 μl DMSO，微振蕩器振蕩10 min。以酶標儀于550 nm波長檢測相應的吸光度，取各組均值，實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst33342法檢測細胞凋亡 取對數生長期的HepG2細胞，調整細胞數量至3×105個/孔，以每孔2 ml接種于6孔板，分組為對照組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組，處理48 h后，棄去培養基，用PBS洗滌2次，4%低聚甲醛固定15 min，每孔加入PBS溶解的2 mg/L Hoechst33342 1 ml，避光15 min后，吸棄溶液，用PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察染色并拍照。

1.2.4 Western blot 檢測PARP、Cleaved PARP、ERK1/2、p-ERK1/2、Cleaved caspase3、Cleaved caspase9蛋白表達 收集各組HepG2細胞，4 ℃預冷的PBS洗滌3次，加入400 μl蛋白裂解液(含100 mmol/L 的PMSF 4 μl)，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取蛋白上清液，加入5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10 min，收集總蛋白。SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離蛋白，然后轉印至硝酸纖維素膜(PVDF)上。用5%脫脂牛奶封閉3 h后，加入常規一抗，4 ℃搖床過夜。TBST洗滌3次，加入相應二抗孵育1 h后，TBST洗滌3次，ECL化學發光顯影，Bio-Rad照相系統進行照相并用Image-J軟件進行圖片分析。

2 結果

2.1 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用 5-氟尿嘧啶按相應濃度(0、0.04、0.2、1、5、25、125、625 μmol/L)分別作用肝癌HepG2細胞24、48、72 h后，對肝癌HepG2細胞增殖呈濃度和時間依賴性抑制，見圖1。黃芪皂苷Ⅱ(20、40、80 μmol/L)聯用10 μmol/L 5-氟尿嘧啶作用48 h后，可以顯著增加5-氟尿嘧啶對HepG2細胞的抑制作用(F=87.43,P<0.05,P<0.01)，見圖2。

2.2 黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對肝癌HepG2細胞促凋亡作用 Western blot結果顯示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組較5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組凋亡相關蛋白PARP出現明顯裂解(F=517.3,P<0.05,P<0.01)，見圖3。Hoechst33342染色分析各組細胞凋亡情況，結果顯示5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組、5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組較5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組細胞凋亡水平升高，見圖3。

圖1 5-氟尿嘧啶對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用與同一時間點0 μmol/L 5-氟尿嘧啶組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖2 黃芪皂苷Ⅱ聯合5-氟尿嘧啶對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用

1：對照組；2：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；3：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組；4：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；5：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3 黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2的表達 40 μmol/L黃芪皂苷Ⅱ分別作用HepG2細胞3、6、12、24、48 h后，Western blot檢測各組p-ERK1/2、ERK1/2

圖3 黃芪皂苷Ⅱ聯合5-氟尿嘧啶對肝癌HepG2細胞促凋亡作用

A：對照組；B：.5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(20 μmol/L)組；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(80 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較：#P<0.05，##P<0.01

表達，結果顯示p-ERK1/2隨作用時間增加而減少(F=35.48,P<0.05)，見圖4。

圖4 黃芪皂苷Ⅱ抑制p-ERK1/2蛋白的表達與0 h比較：#P<0.05，##P<0.01

2.4 聯用PD98059增加5-氟尿嘧啶對HepG2細胞的促凋亡作用 20 μmol/L PD98059聯合10 μmol/L 5-氟尿嘧啶增加HepG2細胞內凋亡蛋白Cleaved caspase3、Cleaved caspase9的表達(F=195.5,P<0.05)；PD98059阻斷ERK1/2通路后，黃芪皂苷Ⅱ對Cleaved caspase3、Cleaved caspase9促進作用并未明顯增加。Hoechst33342染色分析結果與上訴結果一致，見圖5。

3 討論

化療作為治療腫瘤的重要手段被廣泛運用于臨床，而腫瘤細胞對化療藥物抵抗是造成療效降低的重要原因。聯合給藥是解決臨床化療藥物抵抗的重要方法之一，有較好的運用前景。黃芪作為傳統中草藥，其抗腫瘤的作用受到學者的廣泛重視。黃芪多糖、黃芪皂苷等黃芪提取物的抗腫瘤特性已經成為目前抗腫瘤治療的研究熱點之一。

ERK1/2屬于有絲分裂原激活蛋白激酶家族，作為腫瘤治療的新靶點被廣泛認知[6-7]。研究[7]表明ERK1/2可以通過細胞內信號轉導級聯參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等一系列生理活動。馮丹 等[8]發現抑制ERK1/2表達可以增加5-氟尿嘧啶抗人胃癌細胞增殖作用，譚雪梅 等[9]發現5-氟尿嘧啶聯用ERK1/2特異性抑制劑PD98059可以增加5-氟尿嘧啶對小鼠黑色素瘤細胞的促凋亡作用。

本研究結果顯示黃芪皂苷Ⅱ通過下調p-ERK1/2的表達增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞HepG2增殖抑制作用。合用ERK1/2特異性抑制劑PD98059后，黃芪皂苷Ⅱ對凋亡蛋白Cleaved caspase 3、Cleaved caspase 9的表達促進作用并未顯著增加，Hoechst33342染色結果也表明阻斷ERK1/2可以增加5-氟尿嘧啶對HepG2的促凋亡作用。而PD98059作用后，黃芪皂苷Ⅱ對HepG2促凋亡作用并未顯著增加。綜上所述，黃芪皂苷Ⅱ增加5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞株HepG2增殖抑制作用，其機制可能與抑制p-ERK1/2的表達有關。

圖5 聯用PD98059 增加5-氟尿嘧啶對HepG2細胞的促凋亡作用 A：對照組；B：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組；C：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)組；D：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)組；E：5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)+黃芪皂苷Ⅱ(40 μmol/L)+PD98059(20 μmol/L)組；與5-氟尿嘧啶(10 μmol/L)組比較，##P<0.01

[1] 陳 冬,王仁本.原發性肝癌外放療臨床應用現狀[J].中華腫瘤防治雜志,2015,22(1):76-80.

[2] 劉 暢,劉 平,慕永平,等.黃芪湯治療慢性肝病研究進展[J].世界中醫藥,2015,10(2):157-61.

[3] 謝 晶,夏瑞祥.黃芪總苷誘導NB4凋亡過程中死亡受體通路分子變化[J]. 安徽醫科大學學報,2013,48(1):12-5.

[4] 張 虎,李 治.黃芪注射液對慢性心力衰竭患者血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6及血管緊張素Ⅱ的影響[J]. 實用臨床醫藥雜志,2014,18(23):17-9.

[5] Huang C, Xu D, Xia Q, et al. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance of human hepatic cancer cells by Astragaloside II[J]. J Pharm Pharmacol，2012，64(12):1741-50.

[6] 李 磊,程豐偉,王 芳,等.TLR7激活對Hela細胞增殖的影響[J]. 安徽醫科大學學報,2014,49(7):910-2,922.

[7] Esmaeili M A, Farimani M M, Kiaei M.Anticancer effect of calycopterin via PI3K/Akt and MAPK signaling pathways, ROS-mediated pathway and mitochondrial dysfunction in hepatoblastoma cancer(HepG2) cells[J].Mol Cell Biochem,2014, 397 (1-2):17-31.

[8] 馮 丹,劉 靜,曲秀娟,等.MEK/ERK抑制劑影響胃癌細胞對5-FU敏感性及其機制的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2011,18(5):321-4.

[9] 譚雪梅,鄭 輝,洪學軍. ERK1,2抑制劑聯合5-FU對B16細胞增殖和凋亡的影響[J]. 暨南大學學報(自然科學與醫學版),2009,30(6):606-9.

Increasing inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells to 5-fluorouracil by AstragalosideⅡ

Wu Chao1，Xu Dujuan1,2，Yang Cui1，et al

(1College of Pharmacy,Anhui Medical University,Hefei 230032;2Dept of Pharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To investigate the Astragaloside II increasing inhibition of human hepatic cancer (HepG2)cells by 5-fluorouracil and its possible mechanism. Methods The HepG2 inhibiting rate by 5-fluorouracil after alone or jointly acting on cells was detected by MTT method; cells apoptosis was detected by Hoechst33342 staining. The expressions of ERK1/2，p-ERK1/2，PARP,Cleaved PARP,Cleaved caspase 3 and Cleaved caspase 9 proteins were measured by Western blot. Results MTT staining showed that 5-fluorouracil inhibited the proliferation of HepG2 cells and presented dose and time-dependence. Furthermore, combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could further significantly enhance the effect of 5-fluorouracil on cancer cells inhibition (P<0.05). Western blot result proved that combining the Astragaloside II with 5-fluorouracil could increase the expression of Cleaved PARP (P<0.05). Hoechst33342 staining result further validated the level of apoptosis cells was far more increased in the combination group than the 5-fluorouracil group. Moreover, Western blot result also showed that Astragaloside II inhibited the phosphorylation of ERK1/2. Combining the inhibitor of ERK1/2 (PD98059) with 5-fluorouracil may increase apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase3, Cleaved caspase 9 in HepG2 cells. Astragaloside II showed negative increasing trend of apoptosis rate and the expressions of apoptosis related proteins like Cleaved caspase 3, Cleaved caspase 9 by 5-fluorouracil after blocking ERK1/2 in HepG2 cells. Conclusion Astragaloside II could increase inhibition of human hepatic cancer HepG2 cells by 5-fluorouracil, and the mechanism may be related to inhibiting p-ERK1/2 pathway.

Astragaloside II; 5-fluorouracil ; HepG2 cells; cell apoptosis

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.036.html

安徽省自然科學基金(編號:11040606M222)

1安徽醫科大學藥學院，合肥 230032

2安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，合肥 230022

武 超，男，碩士研究生；

許杜娟，女，博士，主任藥師，責任作者，E-mail:1465102325@qq.com

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0078-05

2015-09-30接收