CD90和CXCR4在肝癌中的表達及其與術后早期復發的關系

馬 杰，盛治勇，許戈良，劉文斌，潘婷婷，姚啟楊，李建生，馬金良，莢衛東，葛勇勝，余繼海，張傳海，任維華，徐治軍

?

CD90和CXCR4在肝癌中的表達及其與術后早期復發的關系

馬 杰1，盛治勇2，許戈良1，劉文斌1，潘婷婷1，姚啟楊1，李建生1，馬金良1，莢衛東1，葛勇勝1，余繼海1，張傳海1，任維華1，徐治軍1

目的 研究白細胞分化抗原90(CD90)和趨化因子受體4(CXCR4)在肝細胞癌組織中的表達及其與術后早期復發的關系。方法 采用免疫組化法檢測140例肝癌組織標本中CD90和CXCR4蛋白的表達情況，并分析二者之間的關系及其與肝癌術后早期復發間的關系。結果 肝癌組織標本中CD90陽性表達率和CXCR4高表達率分別為80.71%和61.43%；CD90和CXCR4在肝癌中的表達均與腫瘤的大小、結節數、血管侵犯和TNM分期相關(P<0.05)，而與年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)和肝硬化均無關；CD90與HBsAg狀態和腫瘤分化程度相關(P<0.05)，而CXCR4與腫瘤包膜相關。CD90陽性表達和CXCR4高表達呈正相關性(r=0.394，P<0.001)。單因素分析結果表明，肝癌早期復發與腫瘤大小、結節數、血管侵犯、TNM分期、CD90和CXCR4蛋白的表達程度均相關(P<0.05)，而與患者的年齡、性別、HBsAg狀態、AFP、肝硬化、腫瘤分化程度和包膜無關。多因素分析表明，血管侵犯、CD90蛋白陽性表達和CXCR4高表達是肝癌早期復發的獨立危險因素。受試者工作特征(ROC)曲線結果提示，CD90和CXCR4能預測肝細胞癌患者的早期復發，ROC曲線下面積(AUC)分別為0.648和0.657。結論 CD90陽性表達和CXCR4高表達與肝細胞癌術后早期復發有關，并可以作為肝細胞癌早期復發的獨立預后因素。

癌；肝細胞；抗原，Thy-1；趨化因子受體4；復發

肝細胞癌(簡稱“肝癌”)是富含血管的惡性腫瘤，且具有侵襲血管的特點[1]。目前，外科手術仍然是肝癌的一線治療手段，但是術后高的復發率仍是影響患者長期生存的關鍵[2]。肝癌干細胞被認為是肝癌發生、發展、轉移和復發的根源之一[3]。研究[4]表明，白細胞分化抗原90(cluster of differentiation 90, CD90)是肝癌干細胞標記分子，且其標記的肝癌細胞表現出內皮細胞的特性，并與肝癌的術后復發密切相關。趨化因子受體4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)是目前備受關注的趨化因子受體，在肝癌組織表達上調，與肝癌的進展有關[5]。該研究采用免疫組化法檢測CD90和CXCR4蛋白在肝癌組織中的表達，并探討了二者表達的關系及其與肝癌早期復發的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2009年1月～2013年2月于安徽醫科大學附屬省立醫院肝臟外科首次行手術切除的肝癌組織標本140例，術后均經病理檢查證實，臨床病歷資料完整。術前均未行放療、化療和介入等相關輔助治療。男107例，女33例，年齡21～78(51.7±12.4)歲。術前肝功能評分均為Child-Pugh A級。術后隨訪：采用門診復查和定期電話回訪進行，術后1年內每2～3個月復查1次，以后每3～6個月復查1次，每次常規行甲胎蛋白、腹部B超和胸片檢查復發情況，必要時行CT、MRI或PET-CT檢查，隨訪截止到2015年4月。

1.2 主要試劑 兔抗人CD90和CXCR4單克隆抗體購自美國Abcam公司。SP免疫組織化學染色試劑盒PV-6000、濃縮型DAB顯色試劑盒、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液均購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3 免疫組化檢測 所有常規石蠟包埋的組織，制成4 μm厚連續切片，分別行HE和免疫組化染色，按照試劑盒說明書進行染色，最后在光學顯微鏡下觀察顯色情況。

1.4 臨床病理指標 腫瘤早期復發認為是術后2年內復查發現肝內復發或肝外轉移灶，非早期復發為術后2年內未出現肝內復發或肝外轉移灶[6]。腫瘤直徑選取腫瘤最大徑；多結節認為一個結節伴肉眼可見的子灶或兩個以上的結節；血管侵犯是指顯微鏡下血管內有腫瘤組織與血管內膜相連或充滿管腔；腫瘤包膜是指在肉眼下瘤體切面腫瘤組織與周圍組織有清晰的分界，腫瘤壓迫周圍組織形成纖維包膜，而無包膜指瘤體與周圍組織界限不清；肝癌分化程度是依據埃德蒙森-斯坦納(Edmondson-stein)分級而定；肝癌分期按2010版國際抗癌聯盟/美國腫瘤聯合會修訂的原發性肝癌TNM分期標準。

1.5 結果判斷 CD90主要定位于內皮細胞，以出現粗細不等的棕黃色細顆粒為陽性細胞。CXCR4主要定位于腫瘤細胞的質膜，以質膜出現棕黃色為陽性細胞。顯微鏡下雙盲法閱片，高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野，計數每個視野100個細胞中的陽性細胞數。CD90陽性細胞數占癌細胞數的5%以上為陽性，陽性細胞數少于癌細胞總數的5%或全部不著色為陰性[4]。CXCR4陽性細胞數占癌細胞數的20%以上為高表達，陽性細胞數少于癌細胞總數的20%為低表達[7]。

1.6 統計學處理 使用SPSS 16.0軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗，相關分析采用在χ2檢驗的基礎上計算Pearson列聯系數，多因素分析采用Cox回歸分析模型。

2 結果

2.1 CD90在肝癌組織中的表達 CD90 主要定位于內皮細胞，陰性細胞不著色，細胞核呈紫藍色。見圖1。140例肝癌組織中CD90陽性表達率為80.71%(113/140)。CD90的表達與肝癌臨床病理指標的關系見表1。CD90陽性表達在有乙肝病史、腫瘤>5 cm、多結節、微血管受侵犯、腫瘤分化程度Ⅲ/Ⅳ級、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的患者高于無乙肝病史、腫瘤≤5 cm、單結節、血管未受侵犯、腫瘤分化程度Ⅰ/Ⅱ級、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。CD90的表達與患者的年齡、性別、AFP水平、肝硬化有無以及包膜是否完整無關。

圖1 肝癌組織CD90和CXCR4的表達 SP×400

A：CD90陽性表達；B：CXCR4高表達；C：CD90陰性表達；D：CXCR4低表達

2.2 CXCR4在肝癌組織中的表達 CXCR4主要在肝癌細胞的質膜上表達，陰性細胞不著色。見圖1。140例肝癌組織中CXCR4陽性表達率為61.43% (86/140)。CXCR4的表達與肝癌臨床病理指標的關系見表1。CXCR4高表達在腫瘤>5 cm、多結節、血管受侵犯、包膜不完整、TNM分期Ⅲ/Ⅳ期患者高于腫瘤≤5 cm、單結節、血管未受侵犯、包膜完整、TNM分期Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。CXCR4的表達與患者的年齡、性別、AFP水平高低、肝硬化有無和腫瘤分化程度無關。

表1 肝癌臨床病理指標與CD90和CXCR4的關系(n)

2.3 CD90和CXCR4在肝癌組織中表達的相關性 CD90與CXCR4共同表達陽性者80例，共同表達陰性者21例。113例CD90表達陽性病例中，CXCR4高表達者80例(70.80%)，27例CD90表達陰性病例中，CXCR4高表達者6例(22.22%)，經χ2檢驗(χ2=21.702)計算Pearson相關分析檢驗，CD90陽性表達與CXCR4高表達在肝癌組織中表達呈正相關性(r=0.394，P<0.001)。

2.4 CD90、CXCR4與肝癌早期復發的關系 140例肝癌患者早期復發85例，早期復發率為60.71%。CD90陽性表達者早期復發率為70.80%(80/113)，陰性表達者早期復發率18.52%(5/27)，CD90陽性表達者的早期復發率高于陰性表達者，差異有統計學意義(χ2=24.970，P<0.001)；CXCR4高表達者早期復發率為75.58%(65/86)，低表達者早期復發率37.04%(20/54)，CXCR4高表達者的早期復發率高于低表達者，差異有統計學意義(χ2=20.661，P<0.001)。見表2。

表2 肝癌患者臨床病理指標與早期復發的關系(n)

單因素分析結果表明，肝癌患者的早期復發與腫瘤的大小、結節是否數個、血管是否受侵犯、TNM分期、CD90和CXCR4蛋白的表達程度均相關(P<0.05)，但與患者的年齡、性別、HBsAg狀態、AFP水平、肝硬化、腫瘤分化程度和包膜是否完整無關。多因素分析顯示，血管侵犯[相對危險度(relative risk，RR)=2.210，95%可信區間(confidence interval，CI)：1.506～3.245，P<0.001]、CXCR4蛋白表達(RR=1.909，95%CI：1.268～2.873，P=0.002)和CD90蛋白表達(RR=6.191，95%CI：3.124～12.269，P<0.001)是影響肝癌患者早期復發的獨立危險因素。見表3。

表3 多因素分析影響肝癌患者預后的因素

2.5 CD90和CXCR4預測肝癌早期復發的能力 受試者工作特征(ROC)曲線結果顯示，CD90[ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)：0.648，95%CI：0.567～0.729，P<0.001]和CXCR4(AUC=0.657，95%CI：0.578～0.736，P<0.001)能預測肝癌的早期復發。見圖2。

圖2 CD90和CXCR4蛋白表達預測肝癌早期復發的ROC曲線

3 討論

目前，肝癌早期復發的機制尚不完全清楚，其主要原因在于腫瘤的自身因素。肝癌早期復發可能是由于術前腫瘤細胞已離開原發部位或手術操作(如腫瘤接觸分離和間斷性肝門阻斷等)導致肉眼無法識別的轉移。一般認為，眾多的腫瘤細胞可以進入血液循環，但僅極少數具有干細胞特性的“種子”能逃離免疫監視等而幸存，最終遷移到合適的“土壤”環境而生存，導致腫瘤的治療后復發。

CD90是一種細胞黏附分子免疫球蛋白，在肝臟的發育過程中表達于卵原細胞，但在成人肝臟中極少表達。在黑色素瘤中，CD90是微血管內皮細胞活化的標志，參與腫瘤新生血管的形成。本研究顯示，CD90標記的細胞在肝癌組織中不僅具有高的陽性表達率，而且也表現出微血管內皮細胞的形態特征，這與相關研究[4]結果一致，且CD90標記的這群細胞具有腫瘤干細胞的特性已被證實。這一結果的原因可能是：一方面，CD90標記細胞具有間充質細胞的高侵襲轉移能力，表現出腫瘤干細胞的特性，與腫瘤的轉移復發密切相關[8]；另一方面，CD90標記的細胞具有形成新生血管能力，表現為血管內皮細胞的特性，與腫瘤的快速生長有關[9]。在肝癌中，CD90標記的細胞不僅存在于人肝癌細胞系和肝癌組織，而且也存在于循環的外周血[4]。目前，單純的外科手術僅去除了肝癌病灶，但不能根除已進入血液循環中的腫瘤干細胞，這為肝癌的復發創造了條件。本研究顯示，CD90在肝癌組織中的陽性表達與肝癌的早期復發有關，與文獻[10]報道相符。

趨化因子及其受體的基本功能是趨化特定的細胞到特定的組織器官，其介導的細胞運動是腫瘤細胞定向遷移的關鍵環節，在腫瘤發生、侵襲和轉移的過程中發揮重要作用。有研究[7]顯示，CXCR4在肝癌組織中高表達，且其配體SDF-1在肝癌病灶周圍組織中高表達，這為腫瘤細胞的定向遷移創造了條件，與肝癌的術后轉移復發有關。本研究顯示，CXCR4高表達與CD90陽性表達存在正相關。CXCR4在CD90標記的肝癌干細胞高表達[4]，最近有研究者從肝癌細胞系HepG2中分離出了少量的共表達CD90和CXCR4的肝癌細胞[11]，并證明其不僅具有腫瘤干細胞的成瘤特性，而且表現出較強的轉移能力。這從一個新的角度解釋了肝癌的復發，但其機制仍待于深入研究。

綜上所述，CD90和CXCR4蛋白的表達與肝癌的早期復發有關，且可作為肝癌早期復發的獨立預后因素。肝癌早期復發對患者的預后具有顯著的影響，早發現肝癌術后復發是當前肝癌研究的重點。發現肝癌術后復發能盡可能早地采取針對性的防治措施和提高患者的總體療效。因此，尋找預示肝癌早期復發的標志具有重要的臨床意義。

[1] Paschoal J P, Bernardo V, Canedo N H, et al. Microvascular density of regenerative nodule to small hepatocellular carcinoma by automated analysis using CD105 and CD34 immunoexpression[J]. BMC Cancer, 2014, 14:72.

[2] Fan S T, Mau Lo C, Poon R T, et al. Continuous improvement of survival outcomes of resection of hepatocellular carcinoma: a 20-year experience[J].Ann Surg, 2011, 253(4): 745-58.

[3] Yamashita T, Wang X W. Cancer stem cells in the development of liver cancer[J]. J Clin Invest , 2013, 123(5): 1911-8.

[4] Yamashita T, Honda M, Nakamoto Y, et al. Discrete nature of EpCAM+ and CD90+ cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2013, 57(4): 1484-97.

[5] Ghanem I, Riveiro M E, Paradis V, et al. Insights on the CXCL12-CXCR4 axis in hepatocellular carcinoma carcinogenesis[J]. Am J Transl Res, 2014, 6(4): 340-52.

[6] 周 崢,解長佶,曾志平,等. 173例肝癌切除術后早期復發時間分析[J]. 中華肝膽外科雜志,2014,20(10): 746-7.

[7] Neve Polimeno M, Ierano C, D′Alterio C, et al. CXCR4 expression affects overall survival of HCC patients whereas CXCR7 expression does not[J]. Cell Mol Immunol, 2015,12(4):474-82.

[8] Karnoub A E, Dash A B, Vo A P, et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis[J]. Nature, 2007, 449(7162): 557-63.

[9] Wang R, Chadalavada K, Wilshire J, et al. Glioblastoma stem-like cells give rise to tumour endothelium[J]. Nature, 2010, 468(7325): 829-33.

[10] Guo Z, Li L Q, Jiang J H, et al. Cancer stem cell markers correlate with early recurrence and survival in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol,2014, 20(8):2098-106.

[11] Zhu L, Zhang W, Wang J, et al. Evidence of CD90+CXCR4+ cells as circulating tumor stem cells in hepatocellular carcinoma[J]. Tumour Biol, 2015, 36(7):5353-60.

Expressions of CD90 and CXCR4 are associated with early recurrence after resection of hepatocellular carcinoma

Ma Jie1, Sheng Zhiyong2, Xu Geliang1, et al

(1Dept of Hepatic Surgery, The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofHepatopancreatobiliarySurgery,Hefei230001;2GraduateSchoolofUniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026)

Objective To study expressions of CD90 (Thy-1) and C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4) in hepatocellular carcinoma (HCC), and its relationship with early recurrence after resection of HCC. Methods A total of 140 HCC tissue specimens were used for immunohistochemical staining of CD90 and CXCR4 expressions, and the correlation between the two proteins and early recurrence was also analyzed. Results The positive expressions rate of CD90 was 80.71% and the over-expressions rate of CXCR4 was 61.43% in HCC tissue specimens. The expressions of CD90 and CXCR4 were correlated with tumor size, the number of tumor nodes, vascular invasion, and TNM stage (P<0.05). CD90 expressions was correlated with HbsAg status and the tumor differentiation degree in HCC tissue(P<0.05), and CXCR4 expressions was correlated with tumor capsule(P<0.05). The expressions of CD90 and CXCR4 were not correlated with age, sex, liver cirrhosis, and tumor capsule. There was significant positive correlation between CD90 and CXCR4 (r=0.394,P<0.001). Univariate analysis showed that the early recurrence of HCC was correlated with tumor size, the number of tumor nodes, vascular invasion, TNM stage, and the expressions of CD90 and CXCR4 (P<0.05), but not significantly correlated with age, sex, HbsAg status, AFP, liver cirrhosis, tumor differentiation degree and tumor capsule. Multivariate analysis showed that the vascular invasion and expressions of the two proteins, CD90 and CXCR4, were independent risk factors for early recurrence after resection of HCC. The results of receiver operating characteristic (ROC) curve showed that expressions of CD90 and CXCR4 might be the most important factors predicting the early recurrence of HCC after resection, and the areas under curve (AUC) were 0.648 and 0.657 respectively. Conclusion The expressionss of CD90 and CXCR4 are related to the early recurrence of HCC after resection, and both can be used as indeendent-prognosis factors for the early relapse with HCC.

carcinoma; hepatocellular; antigen; Thy-1; chemokine receptor-4; recurrence

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.062.html

安徽省自然科學基金(編號：1408085MKL71)；安徽省科技平臺建設計劃項目(編號：1206c0805035)

1安徽醫科大學附屬省立醫院肝臟外科、肝膽胰外科安徽省重點實室，合肥 230001

2中國科學技術大學研究生院，合肥 230026

馬 杰，男，碩士研究生；

許戈良，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail: xugeliang2007@163.com

R 735.7

A

1000-1492(2016)01-0129-05

2015-10-12接收